B型肝炎ウイルスのHBs抗原が関与する肝発癌機序の解明に関する研究

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09033
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 加藤 孝宣 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (20333370)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: B型肝炎ウイルス / HBs抗原 / 肝発癌

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、HBVの遺伝子型が肝発癌に与える影響の違いに注目し、国内で主に検出される遺伝子型株のHBs抗原の細胞内蓄積について検討を行った。遺伝子型A, B, C株のHBs抗原発現ベクターをそれぞれ数クローンずつ作製し、培養細胞に導入後した後に細胞内と上清中のHBs抗原量を測定した。培養細胞内と上清中のHBs抗原量の比を見ることで HBs抗原の細胞内蓄積を評価した。その結果、遺伝子型C株のHBs抗原は遺伝子型A株及びB株のHBs抗原に比べ培養細胞内に蓄積することが明らかになった。そこで、この遺伝子型C株のHBs抗原領域の細胞内蓄積に関与している場所を同定するため、遺伝子型A株、B株のコンセンサス配列と、遺伝子型C株のコンセンサス配列のキメラHBs抗原発現ベクターを作製し、HBs抗原の細胞内蓄積の評価を行った。その結果、遺伝子型C株のHBs抗原領域の第一膜貫通領域よりN末端部分のアミノ酸がこのHBs抗原の細胞内蓄積に関与していることが明らかとなった。
現在、HBs抗原のみでなく、preS1やpreS2を含むHBs抗原領域やHBVゲノムの1.4倍長を持ちウイルスの生成が観察されるコンストラクト等でも同様の事象が観察されるか検討を行っている。さらに今後は、これらの発現ベクターを導入した細胞においてERストレスやROSの産生が増強されないか検討を進める予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年までの検討では、HBs抗原の細胞内蓄積に影響を与える変異は同定されなかった。本年度は、国内で検出されるHBVの主要な遺伝子型A, B, C株のHBs抗原領域を培養細胞内で発現するベクターを構築し、遺伝子型がHBs抗原の細胞内蓄積に与える影響について検討を行った。HBs遺伝子のN末端にFLAGタグを挿入した発現ベクターを構築し、遺伝子型Aはコンセンサス配列を含む５株、遺伝子型Bはコンセンサス配列を含む8株、遺伝子型Cはコンセンサス配列を含む11株を準備した。これらの発現ベクターをHepG2細胞に導入し、培養上清中と細胞内のHBs抗原量を測定することで、培養細胞内へのHBs抗原の蓄積を評価した。その結果、遺伝子型C株のHBs抗原の発現では、他の遺伝子型株に比べ培養細胞内でのHBs抗原量が高く、HBs抗原が細胞内に蓄積していると考えられた。そこで、この細胞内のHBs抗原蓄積に関与する遺伝子型C株のHBs抗原内の領域を同定するため、遺伝子型C株のコンセンサス配列と遺伝子型A株、B株のコンセンサス配列のキメラ株発現ベクターを作製し、培養細胞内でのHBs抗原の蓄積を評価した。その結果、遺伝子型A株、B株のコンセンサス配列の第一膜貫通領域よりN末端部分を遺伝子型C株に置換したコンストラクトでは、HBs抗原が培養細胞内に蓄積するようになり、逆に遺伝子型C株のコンセンサス配列のN末端領域を遺伝子型A株、B株に置換したコンストラクトでは、培養上清中に放出されるようになった。遺伝子型A株とC株及び遺伝子型B株とC株のN末端部分にはそれぞれ2つの異なるアミノ酸変異を認めており、遺伝子型C株のこれらのアミノ酸がHBs抗原の細胞内蓄積に関与していると考えられた。

Strategy for Future Research Activity

本年度の検討の結果から、HBVの遺伝子型がHBs抗原の細胞内蓄積に影響を与えていると考えられた。さらにこのHBs抗原の細胞内蓄積には、遺伝子型C株のHBs領域のN末端のアミノ酸変異が関与していた。今後は、これらのN末端のアミノ酸変異が関わるHBs抗原の細胞内蓄積がpre-S1領域やpre-S2領域を含んだHBs抗原でも同様に観察されるか、また感染性ウイルス粒子の産生が可能なHBVゲノムの1.4倍長を持つ複製コンストラクトでも再現できるか検討を行う。さらに細胞内でHBs抗原が蓄積する部位についても検討する予定である。
また、肝発癌への関与を考える上では、観察されたHBs抗原の細胞内蓄積が宿主細胞のERストレスや酸化ストレス、細胞周期、アポトーシス感受性等に与える影響の解析が重要となる。今後は遺伝子型C株のHBs領域の導入により観察されるHBs抗原の細胞内蓄積が宿主細胞に与える影響について検討を行っていく。

Causes of Carryover

年度末納品等にかかる支払いが平成29年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成28年度分についてはほぼ使用済みである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記のとおり。