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2015 Fiscal Year Research-status Report

心不全におけるKv1.3およびKCa3.1がエフェクターT細胞分化に果たす役割

Research Project

Project/Area Number 15K09129
Research InstitutionTokyo Women's Medical University

Principal Investigator

佐藤 加代子  東京女子医科大学, 医学部, 講師 (20246482)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 鈴木 敦  東京女子医科大学, 医学部, 助教 (00625626)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords臨床血管学 / 心不全 / T細胞 / 免疫記憶 / カリウムチャンネル / サイトカイン
Outline of Annual Research Achievements

人口動態統計によると、死亡原因に占める虚血性心疾患および心不全の割合が増加している。本研究では、虚血性心疾患や心血管疾患の予後を規定する心不全の病態に重要な炎症性サイトカイン、エフェクターT細胞(Teff)の分化増殖や免疫記憶、ヘルパーT細胞(Th)サブセットや障害性T細胞(CTL)の関与について解析した。
虚血性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、弁膜症性心筋症などによる心不全患者では、① 炎症性サイトカインIL-2、IL-6、IL-17、IFNγの高値を認めた。また、②T細胞免疫記憶をナイーブT細胞:TN(CCR7+CD45RA+)、セントラルメモリーT細胞:TCM(CCR7+CD45RA-)、エフェクターメモリーT細胞:TEM(CCR7-CD45RA-)、TEMRA(CCR7-CD45RA+)について検討したところ、TEM(CCR7-CD45RA-)、TEMRA(CCR7-CD45RA+)発現亢進を認めた。また、TEMより分化増殖したTeffであるCD4+Thサブセット:IFNγ+Th1、IL-4+Th2、IL-17+Th17、Foxp3+CD25+制御性T細胞 (Treg)、CTLサブセット:CD4+TRAIL+CTL、CD8+perforin+granxymeB+CTLを解析した結果、心不全では細胞障害性の強いTh1、Th17、CD8+CTLの発現亢進を認めた。③ TNよりTEMへの分化過程に寄与するカリウムチャンネルKV1.3の特異的阻害剤PAP-1処理により、活性化したTeffであるTh1、Th17、CD8 CTL発現減少を認めた。さらに、臨床で使用されているKV1.3阻害効果のあるアンカロン(AMD)投与例での免疫記憶、Teffへの影響と臨床効果を解析したところ、AMD投与例で血中BNP、IL-6の低下、 Th1、Th17、CD8+CTLの発現減少を認めた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1. 慢性心不全患者におけるサイトカインと臨床所見の検討:心不全患者(HF群)末梢血では、BNP、hsCRP、炎症性T細胞サイトカインIL-2、IL-6、IL-17、IFNγが高値で、Teffの活性化、特にTh1、Th17、CTLの活性化が慢性心不全の病態を増悪する体液性因子の一つと考えられた。
2. 慢性心不全群における免疫記憶とエフェクターT細胞の検討:Cont群およびHF群より末梢単核球(PBMC)を単離し、CD4+T細胞およびCD8+T細胞におけるTN(CCR7+CD45RA+)、TCM(CCR7+CD45RA-)、TEM(CCR7-CD45RA-)、TEMRA(CCR7-CD45RA+)発現による免疫記憶をFACSで解析した。また、エフェクター機能を発揮するTeffであるCD4+Thサブセット(Th1、Th2、Th17、Treg)、CTLサブセット(CD4+TRAIL+CTL、CD8+perforin+granxyme B+CTL)を解析した。その結果、HF群ではCD4+T細胞、CD8+T細胞ともにTEM、TEMRAの増加、CD69陽性活性化Th1、Th17、CD8+CTLの増加を認めた。すなわち、心不全ではTEMが活性・分化増殖しTeffとなることで、心不全の病態増悪に関与していると推測された。
3.  電位依存性K+チャンネル(Kv1.3)阻害剤のエフェクターT細胞への影響:T細胞受容体(TCR)刺激により活性化状態となるとKv1.3はTEM細胞で発現亢進し、膜電位やCa2+シグナルの制御に寄与する。そこで、HF群のPBMCを特異的KV1.3阻害薬PAP-1、または非特異的KV1.3阻害効果のある抗不整脈剤アンカロンで処理したところ、活性化したTeffであるTh1、CD8+CTL の発現減少が認められ、心不全のTeff機能亢進にKv1.3が重要であると考えられた。

Strategy for Future Research Activity

H28年度は、H27年度研究結果を総括し不十分な点を検討すると伴に以下の研究を進める。
1. 慢性心不全群におけるT細胞のKv1.3とCa2+活性化K+チャンネル(KCa3.1)の機能解析:静止状態ではKv1.3およびKca3.1は低発現であるが、TC刺激により活性化するとKv1.3はTEM細胞で発現亢進し、膜電位やCa2+シグナルの制御に寄与する。HF群でエフェクター機能が亢進していたTeffでのKv1.3およびKCa3.1チャンネル電流をパッチクランプ法で解析する。
2. Kv1.3とKCa3.1の免疫シナプス形成におけるT細胞活性化機序の解析:TCR刺激によりKv1.3およびKCa3.1は免疫シナプスにZAP70、p56lck、CD3と複合体を形成し、中心部超分子クラスター(c-SMAC)から周辺部超分子クラスター(p-SMAC)に移動、細胞内Ca2+濃度の上昇とT細胞活性化が起こる。そこで、心不全の免疫シナプス形成にもKv1.3およびKCa3.1、ZAP70、p56lck、CD4、CD8、CD3が関与するのか、共焦点レーザー顕微鏡で観察する。
3. Kv1.3およびKCa3.1阻害剤のTeffおよび免疫シナプスへの影響:HF群で活性化していたTeffや免疫シナプスが特異的KV1.3およびKCa3.1阻害剤で抑制されるか検討する。PBMCを特異的KV1.3阻害剤PAP-1、またはKCa3.1阻害剤またはTRAM-34で処理後、TCR刺激を加え、パッチクランプでK+電流の減少に伴い、TN、TCM、TEM、TEMRA 、CD4+Thサブセット、CD8+サブセットの発現やサイトカイン産生量を解析する。また、シナプス形成にも変化を認めるか共焦点レーザー顕微鏡で観察する。
次年度の研究費の使用計画: 研究費は研究遂行に必要な消耗品、人件費、旅費などに本年同様適切に使用する。

Causes of Carryover

本年度途中で、患者血中サイトカインの測定を行うCBA kit、および患者末梢単核球のT細胞解析を行うために使用していたflow cytometerが故障し修理不能となった。そのため異なるflow cytometerで解析をすることとなり、調整に非常に時間を要した。その結果、試薬や消耗品の使用が大幅に減少、注文が遅れ次年度納入となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は本年度に使用予定であったCBA kitを用いた解析、およびFACSによるT細胞解析は順調に研究が進行予定である。さらに、パッチクランプによるT細胞のKv1.3およびKCa3.1機能解析、共焦点レーザー顕微鏡による免疫シナプス解析に必要な試薬や抗体などの消耗品の費用が高額となるため次年度使用額が必要である。

  • Research Products

    (13 results)

All 2016 2015

All Journal Article (2 results) (of which Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (11 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 3 results)

  • [Journal Article] 急性冠症候群におけるPSGL-1陽性T細胞の役割.2015

    • Author(s)
      喜多村一孝, 佐藤加代子, 萩原誠久
    • Journal Title

      適応医学

      Volume: 19(2) Pages: 30-34

    • Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] THE ROLE OF PSGL-1-EXPRESSING CD4 T CELLS IN THE ATHEROSCLEROTIC DEVELOPMENT AND PLAQUE INSTABILITY.2015

    • Author(s)
      Kayoko SATO, Kazutaka KITAMURA, Atsushi SUZUKI, Nobuhisa HAGIWARA
    • Journal Title

      Annual Report of the Japan Research Promotion Society for Cardiovascular Disease

      Volume: 29 Pages: 23-27

    • Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] Activation of Central Effector Memory and Effecter T Cells in Patients with Heart Failure.2016

    • Author(s)
      Tatsuro Iida, Kayoko Sato, Kitamura Kazutaka, He Yun-chi, Keigo Kanbayashi, Atsushi Suzuki, Tsuyoshi Shiga, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      第80回日本循環器学会総会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-03-19
  • [Presentation] Dipeptidyl Peptidase 4 (DPP-4) Inhibitor Improve the Atherosclerosis and Glomerular Tissue Damage through Suppressing the Effector T Cell Function.2015

    • Author(s)
      He Yun-Chi, Kayoko Sato, Kazutaka Kitamura, Kenta Uto, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      第32回国際心臓研究学会日本部会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-12-11
  • [Presentation] 心血管病変におけるTRAIL発現T細胞/DR5発現標的細胞の役割と新規治療戦略2015

    • Author(s)
      佐藤加代子
    • Organizer
      脳心血管抗加齢研究会2015
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2015-11-29
    • Invited
  • [Presentation] The Role of PSGL-1 on T cells in the atherosclerotic development and plaque instability2015

    • Author(s)
      Kayoko Sato, Kitamura Kitamura, Fukushima Keiko, Yun-Chi He, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      第44回日本免疫学会学術集会
    • Place of Presentation
      札幌
    • Year and Date
      2015-11-19
  • [Presentation] Cytotoxic PSGL-1 expressing CD4 T cells in acute coronary syndrome2015

    • Author(s)
      Kazutaka Kitamura, Kayoko Sato, Atsushi Suzuki, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      第43回日本臨床免疫学会総会
    • Place of Presentation
      神戸
    • Year and Date
      2015-10-23
  • [Presentation] T 細胞の動脈硬化進展と不安定粥腫における役割.2015

    • Author(s)
      佐藤加代子
    • Organizer
      第18回日本栓子検出と治療学会
    • Place of Presentation
      宇都宮
    • Year and Date
      2015-09-25
    • Invited
  • [Presentation] The role of PSGL-1 expressing T cells in acute coronary syndrome.2015

    • Author(s)
      Kayoko Sato, Kazutaka Kitamura,Atsushi Suzuki, Ka Yun-Chi, Nobushisa Hagiwara
    • Organizer
      The 19th Annual Meeting of the Japan Socity for Adaptation Mediocine
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2015-09-13
  • [Presentation] DPP-4 signaling in T cells contributes atherosclerotic development and renal dysfunction.2015

    • Author(s)
      Kayoko Sato, Atsuko Futase, Kazutaka Kitamura, Chieko Masuda, Kenta Uto, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      17th triennial congress of the International Atherosclerosis Society, Amsterdam
    • Place of Presentation
      Amsterdam, the Netherlands
    • Year and Date
      2015-05-25
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 心不全における免疫異常の検討.2015

    • Author(s)
      佐藤加代子
    • Organizer
      第31回吉岡弥生記念講演会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2015-05-22
    • Invited
  • [Presentation] Dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) signaling in T cells contributes atherosclerotic development and renal dysfunction.2015

    • Author(s)
      Atsuko Futase, Kayoko Sato, Kazutaka Kitamura, Chieko Masuda, Kenta Uto, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      第79回日本循環器学会総会
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2015-04-25
  • [Presentation] Soluble TRAIL is a predictive marker of future cardiac event in acute coronary syndrome.2015

    • Author(s)
      Kazutaka Kitamura, Kayoko Sato, Nobuhisa Hagiwara
    • Organizer
      第79回日本循環器学会総会
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2015-04-25

URL: 

Published: 2017-01-06  

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