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2016 Fiscal Year Research-status Report

心不全におけるBNP前駆体の血中濃度増加の分子機序の解明と臨床応用

Research Project

Project/Area Number 15K09138
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

錦見 俊雄  京都大学, 医学研究科, 非常勤講師 (80291946)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 桑原 宏一郎  信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (30402887)
中川 靖章  京都大学, 医学研究科, 助教 (70452357)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
KeywordsproBNP / プロセシング / O型糖鎖修飾 / 心不全 / BNP / microRNA-30 / GALNT
Outline of Annual Research Achievements

野生型ならびにO型糖鎖付着部位のThやSer殘基をAlaに置換した変異型ヒトproBNP遺伝子をラット心筋細胞にレンチウイルスを用いて遺伝子導入し、その培養液を我々の開発したproBNP、Total BNPの測定系で正確に測定し、プロセシングを評価する系を用いて実験を行った。野生型proBNPでは培養液中のproBNP/total BNP比は40%であった。すなわち、通常では約60%が切断されると考えられる。一方、糖鎖修飾部位のThやSer殘基をすべてAlaに置換した変異型ではproBNPはすべてBNP32とNT-proBNPに切断された。このことからヒトproBNPのプロセシングで糖鎖修飾が重要な働きをしていることが明らかとなった。そこで7カ所の糖鎖結合部位で1箇所のみ糖鎖が結合する変異体を作成し、proBNP/total BNP比を検討するとTh71に結合するO型糖鎖が重要である他に、 Th48番目に結合するO型糖鎖も重要である事がわかった。Th71とTh48に結合する糖鎖は相加的に働くことも示した。他の5カ所のO型糖鎖は直接プロセシングに関係しないがTh71とTh48に結合する糖鎖を補助する働きをする。つまり他の5カ所のO型糖鎖だけではプロセシングに関係しないが、Th71とTh48だけでもプロセシングはそれほど低下しない結果が得られた。この2つのTh71とTh48に糖鎖を結合する酵素はsiRNAを用いた実験でGalNAc-transferase (GALNT) 1 and 2が関与する事を示した。さらにGALNT1 と 2の上流にはmicroRNA-30が関与する事を明らかにした。実際臨床例で、重症心不全では軽症心不全に比べてproBNP/total BNP比は増加しておりcGMP/BNP比は低下している事を示した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

proBNPに結合する重要なproBNPの部位、その分子機序を明らかにしてきたが、ヒトproBNPのTh、Ser殘基に結合する糖鎖の実態は不明である。このアプローチ法としては、BNP免疫活性が非常に高い心不全患者のproBNPを精製し、質量分析にかけて解析することが一般的には考えられる。ただし、質量分析に供与するproBNPは現時点では10~100pmolくらいの純度の高い量が必要とされており、このような量を集める事は現状では困難である。また質量分析に供与するには精製が必要で、proBNPを精製するためにイムノアフニティ法が取られる事が多いが、今のところ精製に必要な適切な抗体はなく、このことも研究を困難にしている。最近我々はBNP濃度が約35000pg/mLと著明に高い症例を経験した。この患者のBNPの免疫活性の殆どがproBNPである事が我々の開発したproBNP測定法で確認できた。さらにポリエチレングリコールによる沈殿法でproBNP濃度は1.3%と低下、proteinGカラムを通すと3.3%と低下した。さらにゲル濾過法で、proBNPの免疫活性はIgGよりも少し大きい位置に溶出した。これらの結果からBNP免疫活性著明高値の原因としてproBNPにIgGが結合したmacro-proBNP血症によるものと考えられた。pH3のelution bufferにするとIgGははずれ、本来のproBNPの溶出位置に溶出したことがproBNPの免疫活性から確認された。今後このproBNP-IgG結合のmacro-proBNP血症を使用して、proBNPの精製を進めていき、ある程度の質量が得られたところで質量分析による糖鎖構造の解明を行っていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

このproBNPが約35000pg/mLと高い患者さんの血漿をproteinGカラムでproBNP-IgG分画のみを溶出し、この分画を凍結乾燥する。これをpH3.0のelution bufferに溶解し、ゲル濾過をかけると、IgGがはずれproBNPの溶出するfractionに純度の高い高用量の糖鎖の付いたproBNPが溶出されると考えられる。現在、患者さんの血漿も約10mL得られ、予備実験でこの考えが正しいかを検討しているところである。予備実験でうまくいく結果が得られれば、試料を全部使い、質量分析に供与する予定である。この方法の問題点は回収率にあると考えられ、proteinGカラムの溶出もpHをいろいろ変えて、どのpHが一番適切かを検討していく予定である。
臨床例でもproBNPの病態生理学的意義に関する検討を行っている。これまでの検討で、心房細動例でproBNP/total BNP比が低い事を見いだしている。これは我々が以前に報告したヒト心房組織ではproBNPよりもBNP32の比率が高かったことと矛盾しない結果である。今後多数の症例を集めて、proBNPの心房細動における病態生理学的意義について解析していく予定である。

  • Research Products

    (15 results)

All 2017 2016 Other

All Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Endothelium-derived C-type natriuretic peptide contributes to blood pressure regulation by maintaining endothelial integrity.2017

    • Author(s)
      Nakao K, Kuwahara K, Nishikimi T, Nakagawa Y, Kinoshita H, Minami T, Kuwabara Y, Yamada C, Yamada Y, Tokudome T, Nagai-Okatani C, Minamino N, Nakao YM, Yasuno S, Ueshima K, Sone M, Kimura T, Kangawa K, Nakao K.
    • Journal Title

      Hypertension

      Volume: 69 Pages: 286-296

    • DOI

      10.1161/HYPERTENSIONAHA.116.08219.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] MiR30-GALNT1/2 Axis-Mediated Glycosylation Contributes to the Increased Secretion of Inactive Human Prohormone for Brain Natriuretic Peptide (proBNP) From Failing Hearts.2017

    • Author(s)
      Nakagawa Y, Nishikimi T, Kuwahara K, Fujishima A, Oka S, Tsutamoto T, Kinoshita H, Nakao K, Cho K, Inazumi H, Okamoto H, Nishida M, Kato T, Fukushima H, Yamashita JK, Wijnen WJ, Creemers EE, Kangawa K, Minamino N, Nakao K, Kimura T.
    • Journal Title

      J Am Heart Assoc.

      Volume: 5 Pages: e003601

    • DOI

      10.1161/JAHA.116.003601.

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] The rennin-angiotensin system promotes arrhythmogenic substrates and lethal arrhtymias in mice withnon-ischemic cardiomyopathy2016

    • Author(s)
      2. Yamada C. Kuwahara K. Yamazaki M. Nakagawa Y, Nishikimi T, Kinoshita H, kuwabara Y, Minami T, Yamada Y, Shibata J, Nakao K, Cho K, Arai Y, Honjo H, Kamiya K, Nakao K, Kimura T.
    • Journal Title

      Cardiovasc Res

      Volume: 109 Pages: 162-173

    • DOI

      10.1093/cvr/cvv248.

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] 心不全における血中BNP分子型の多様性とその意義:proBNP, BNP[1-32]関連分子種,   nonglycosylated-NT-BNP,glycosylated-NT-BNPについて.2016

    • Author(s)
      錦見俊雄,中川靖章
    • Journal Title

      循環器内科

      Volume: 79 Pages: 510-516

  • [Journal Article] 分子標的薬と高血圧・循環器疾患2016

    • Author(s)
      錦見俊雄
    • Journal Title

      腎臓内科・泌尿器科

      Volume: 4 Pages: 82-89

  • [Presentation] 病的心筋におけるmiR30-GALNT経路による糖鎖修飾を介したproBNP分泌制御2016

    • Author(s)
      中川靖章、錦見俊雄、桑原宏一郎、木下秀之、稲住英明、森内健史、南野直人、中尾一和、木村剛
    • Organizer
      第20回日本心血管内分泌代謝学会総会(CVMW2016)
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2016-12-16 – 2016-12-17
  • [Presentation] miR-30-GALNT1,2経路による糖鎖修飾調節が病的心筋からのproBNP分泌に関与する2016

    • Author(s)
      中川靖章、錦見俊雄、桑原宏一郎、木下秀之、稲住英明、森内健史、南野直人、中尾一和、木村剛
    • Organizer
      第26回 日本循環薬理学会
    • Place of Presentation
      松本
    • Year and Date
      2016-12-02 – 2016-12-02
  • [Presentation] Secretion of proBNP is regulated by MiR30-GALNTs axis dependent O-linked glycosylation in the pathological myocardium.2016

    • Author(s)
      Yasuaki Nakagawa, Toshio Nishikimi, Koichiro Kuwahara, Hideyuki Kinoshita, Hideaki Inazumi, Kenji Moriuchi, Takao Kato, Naoto Minamino, Kazuwa Nakao, Takeshi Kimura
    • Organizer
      AHA Scientific Session 2016
    • Place of Presentation
      New Orleans, Louisiana, USA
    • Year and Date
      2016-11-13 – 2016-11-16
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Endogenous plasma NT-BNP is glycosylated and undetectable with the current NT-BNP assay system2016

    • Author(s)
      Toshio Nishikimi, Yasuaki Nakagawa, Koichiro Kuwahara, Hideyuki Kinoshita, Chinatsu Yamada, Takeshi Kimura, Kazuwa Nakao
    • Organizer
      The 26th Scientific meeting of the International Society of Hypertension
    • Place of Presentation
      Seoul, Korea
    • Year and Date
      2016-09-24 – 2016-09-29
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] miR30-GALNT経路によるO型糖鎖修飾調節を介した病的心からのproBNP分泌亢進機序2016

    • Author(s)
      中川靖章、錦見俊雄、桑原宏一郎、保野慎治、木下秀之、桒原佳宏、稲住英明、森内健史、上嶋健治、南野直人、中尾一和、木村剛
    • Organizer
      第2回 国際心血管薬物療法学会日本部会(J-ICPS)
    • Place of Presentation
      徳島
    • Year and Date
      2016-06-25 – 2016-06-26
  • [Presentation] O型糖転移酵素GALNTのBNPプロセシング調節への関与2016

    • Author(s)
      中川靖章、錦見俊雄、桑原宏一郎、木下秀之、山田千夏、稲住英明、南野直人、中尾一和、木村剛
    • Organizer
      第89回 日本内分泌学会学術総会
    • Place of Presentation
      京都
    • Year and Date
      2016-04-21 – 2016-04-23
  • [Presentation] miR30-GALNT経路によるO型糖鎖修飾を介したBNPプロセシング調節が病的心筋からのproBNP分泌亢進に寄与する2016

    • Author(s)
      中川靖章、錦見俊雄、桑原宏一郎、保野慎治、木下秀之、桒原佳宏、山田千夏、稲住英明、上嶋健治、南野直人、中尾一和、木村剛
    • Organizer
      第53回 日本臨床分子医学会学術集会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2016-04-15 – 2016-04-16
  • [Presentation] MiR30-GALNTs axis-mediated O-glycosylation plays an important role in the increased secretion of unprocessed pro-brain natriuretic peptide by failing heart2016

    • Author(s)
      Yasuaki Nakagawa, Toshio Nishikimi, Koichiro Kuwahara, Kazuwa Nakao and Takeshi Kimura
    • Organizer
      Keystone symposia
    • Place of Presentation
      Snowbird, Utah, USA
    • Year and Date
      2016-04-03 – 2016-04-07
    • Int'l Joint Research
  • [Book] Endocrinology of the Heart in Health and Disease. Chapter 2 Adrenomedullin.2016

    • Author(s)
      T. Nishikimi, K. Kuwahara, Y. Nakagawa, K Kangawa, and K. Nakao
    • Total Pages
      pp.41-58
    • Publisher
      Elsevier Scinence Imprint:Academic Press
  • [Remarks] 京都大学医学部付属病院循環器内科 基礎研究グループの活動 心血管内分泌代謝グループ

    • URL

      http://kyoto-u-cardio.jp/kisokenkyu/cat236/

URL: 

Published: 2018-01-16  

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