動脈瘤の進展における石灰化因子OPG・RANKL・TRAILネットワークの解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09155
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 三宅 隆 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座准教授 (40219746)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森下 竜一 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (40291439)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 大動脈瘤 / 血管石灰化 / Osteoprotegerin / RANKL

Outline of Annual Research Achievements

動脈瘤の進展・破裂における血管石灰化と慢性炎症の関係を解明するため、OPG-RANKL-TRAILネットワークの解析を行っている。その結果をベースに、動脈瘤および血管石灰化の新規治療法の開発を進めている。
OPG欠損マウスと野生型マウスの腹部動脈瘤モデルのサンプルを使い、瘤壁での炎症反応と骨形成能の評価を行った。OPG欠損マウスでは、外膜側でマクロファージの著明な浸潤を認めた。また、炎症性サイトカインの遺伝子発現は両者とも亢進するが、OPG欠損マウスで有意に高く、インターロイキン6はOPG欠損マウスだけが上昇していた。MMP-2とMMP-9もOPG欠損マウスで有意に高い活性を示すが、動脈瘤ではないOPG欠損マウスでも血管平滑筋細胞のMMP活性が上昇していた。このことから、本来、OPGで抑制されるRANKL-RANK-NFκBが常時活性化し、より強い炎症性因子の発現を示すと考えられた。
一方、組織の石灰化の評価では、OPG欠損マウスの中膜に強い石灰化が認められた。しかし、断裂エラスチンにはカルシウムが沈着するので、この石灰化が能動的な変化かを検討した。骨芽細胞の分化を誘導する蛋白BMP2の遺伝子発現は変化しないが、骨芽細胞が産生するオステオカルシンの遺伝子発現はOPG欠損マウスで有意に上昇していた。このことから、BMP2以外の経路で骨形成が誘導されると考えられ、体循環からの前駆細胞の誘導あるいは平滑筋細胞の骨芽細胞様細胞への分化が示唆された。
細胞培養実験では、血管平滑筋細胞にRANKLと抗OPG抗体の添加だけでは、石灰化は増大しなかった。そこで、RANKLが活性化すると考えられている転写因子のなかで、石灰化を制御するRunx2と炎症を制御する転写因子NFκBを抑制する核酸医薬デコイを設計し、炎症と石灰化の相互関係および核酸医薬による治療法の検討を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

OPG欠損マウスはオスの出産が少ないため繁殖の拡大で対応していたが、出産数が減少した時期があり、一部の動物実験が年度内に実施できなかった。原因は不明であるが、現在は回復している。機序の検討は予定通り進んでいる。
細胞培養実験では、RANKLと抗OPG抗体の添加で石灰化の増大が見られなかったので、刺激に使うRANKLの用量を再設定する必要がある。そのため、転写因子の制御を中心にした検討を先行させることで対応した。
これらの事から、本研究はおおむね順調に進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

基本的には、当初の計画に沿って研究を進める予定である。
1. 培養実験では、RANKL刺激の用量設定を再度行い、分泌される蛋白や酵素の発現プロファイルと転写因子ネットワークの検討を行う。また、抗RANKL抗体による石灰化の抑制が十分はでなかったので、RANKLが活性化する転写因子（Runx2、NFκB）を阻害する核酸医薬を投与し、石灰化に伴う炎症の制御ポイントを解明する。これらの実験を通して、OPG-RANKL-TRAILネットワークのなかで、石灰化に関連した動脈瘤の形成・破裂を制御可能な標的分子を同定する。
2. 動物実験では、石灰化因子と炎症性因子の関係の解明を進めていく。特に、多重免疫染色で骨形成因子と炎症性因子の相互関係を検討する。また、標的細胞を明らかにするため、血管石灰化が体循環からの骨前駆細胞によるものか、血管平滑筋細胞の骨芽細胞様細胞の分化によるものか検討する。PETを使った炎症と石灰化の評価は、動物数を確保後に実施する。
3.細胞実験で石灰化と炎症の抑制が可能な核酸医薬が判明すれば、モデル作成時に局所投与を行い、生体での効果を明らかにする。
4.アンジオテンシンIIの全身投与による動脈解離の検討では、ヒドララジンで血圧を正常化させた実験系で機序の解明を行う。

Causes of Carryover

遺伝子改変動物の出産数が低下した時期があり、一部の動物実験が実施できなかった。そのため、実験に使用する試薬の購入と外注（特殊染色）は中止し、次年度の実験で使用予定とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

実験動物の確保ができなかったため延期した実験は、次年度に実施予定である。そのため、次年度使用額は延期実験の試薬購入などに使用する。次年度の助成金は計画時に予定しているH29年度の実験に使用する。