悪性胸膜中皮腫に対する癌幹細胞を標的とした新規治療法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09200
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 福岡 和也 近畿大学, 医学部附属病院, 准教授 (80305721)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西尾 和人 近畿大学, 医学部, 教授 (10208134)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 悪性胸膜中皮腫 / 癌幹細胞 / 治療法 / 次世代シーケンサー / 遺伝子変異 / 抗癌剤感受性

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、悪性胸膜中皮腫から癌幹細胞を単離・同定し、その遺伝子発現プロファイルを明らかにすることで治療応用に繋げることを目的とする。悪性胸膜中皮腫にみられる癌抑制遺伝子NF-2の不活化によって、遺伝子産物であるMerlinの発現が低下すると、その下流シグナル分子である焦点接着キナーゼ (FAK)の活性が上昇する。FAKは癌幹細胞の増殖と生存に必須のシグナル伝達経路であることから、FAKを制御することで癌を治癒に導くことができる可能性がある。最近、悪性胸膜中皮腫を対象としたFAK阻害剤の国際共同治験が実施されたが、標的となる癌幹細胞の遺伝子変異プロファイルやマーカー分子は明らかにはされていない。平成27年度は、悪性胸膜中皮腫細胞における抗癌剤感受性に関連する遺伝子変異、治療標的となり得る遺伝子変異、疾患特異的な遺伝子変異パターンを探索するために、次世代シーケンサーを用いた遺伝子変異及び融合遺伝子解析を実施した。15種類の悪性胸膜中皮腫細胞株における解析結果から、融合遺伝子は検出されなかったが、癌幹細胞関連遺伝子及び癌関連遺伝子を含めた網羅的遺伝子変異を同定・解析中である。また、これらの悪性胸膜中皮腫細胞株は、抗中皮腫活性を有する殺細胞性抗癌剤であるCisplatin, Pemetrexed, Gemcitabineに対して異なる薬剤感受性パターンを示した。
本研究を継続することによって、悪性胸膜中皮腫に対する癌幹細胞を標的とした新しい治療法の開発が期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成27年度は、悪性胸膜中皮腫における抗癌剤感受性と関連する遺伝子異常、治療標的となり得る遺伝子異常、疾患特異的な遺伝子変異パターンを探索するために、次世代シーケンサーを用いた遺伝子変異及び融合遺伝子解析を実施した。次世代シーケンスは、ライフテクノロジーズ社製のIonProtonを用いて実施した。遺伝子変異解析及び融合遺伝子解析には、Oncomine Comprehensive Assayを用いた。本アッセイでは、DNA解析によって、ターゲットを約170の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子に絞り込んだ解析を行うことが可能である。また、同様にRNA解析によって、22の融合遺伝子の発現解析が可能となる。15種類の悪性胸膜中皮腫細胞株(Mero-14, -25, -41, -48a, -82, -83, -84, -95, NO36, ONE58, HMMME, ACC-MESO-1, ACC-MESO-4, JU77, LO68)から核酸を抽出し解析に供した。同パネルによる解析結果から、融合遺伝子は検出されなかった。現在、癌幹細胞関連遺伝子を含めた網羅的遺伝子変異を同定し、解析中である。また、予備実験の結果から、悪性胸膜中皮腫細胞に抗癌剤を曝露することによって、癌幹細胞を誘導できることが示されたため、抗中皮腫活性を有する殺細胞性抗癌剤による15種類の悪性胸膜中皮腫細胞株の増殖抑制効果を検討した。Cisplatin (CDDP), Pemetrexed (PEM), Gemcitabine (GEM)を72時間、各細胞株に接触させ、50%増殖抑制濃度(IC50値)を算出した。各細胞株に対する、各種抗癌剤のIC50値は、CDDP 0.304～42.3μM, PEM 0.102～>100μM, GEM 0.008～>1μMであり、15種類の悪性胸膜中皮腫細胞株は、各種抗癌剤に対して、異なる薬剤感受性パターンを示した。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度以降は、次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析の結果、悪性胸膜中皮腫細胞株に見出された癌幹細胞関連遺伝子変異及び癌関連遺伝子変異を既報告のデータベースと比較することによって、新規の遺伝子変異及び疾患特異的遺伝子変異を同定する。さらに、悪性胸膜中皮腫における新たな治療標的遺伝子及び分子の探索を試みる。
遺伝子変異と各種抗癌剤感受性との関連性を細胞レベルで検討することによって、各種抗癌剤感受性及び耐性に関連する遺伝子変異を同定する。また、抗癌剤耐性細胞株には、薬剤曝露後に癌幹細胞が高率に誘導されている可能性が高いことから、癌幹細胞を単離し、次世代シーケンサーを用いて、遺伝子発現プロファイルを構築する。さらに、癌幹細胞の検出に有効なマーカー分子を同定する。
細胞株を用いた検討と同様、診断時に得られた胸膜生検組織（生検検体）及びCDDP+PEMもしくは、CDDP+GEMによる導入化学療法後の胸膜切除組織（手術検体）を用いて、悪性胸膜中皮腫における抗癌剤感受性に関連する遺伝子変異、治療標的となり得る遺伝子変異、疾患特異的な遺伝子変異パターンを探索する。さらに、細胞レベルで同定した癌幹細胞の遺伝子発現プロファイル及び、その検出に有効なマーカー分子を用いて、悪性胸膜中皮腫の増殖・進展及び薬剤耐性に関わる癌幹細胞の役割を明らかにする。

Causes of Carryover

遺伝子変異解析に用いた試薬代金が、当初の見積りよりも安価となったため、次年度使用額が生じました。

Expenditure Plan for Carryover Budget

臨床検体における遺伝子発現解析のための核酸抽出等の試薬購入に使用する予定です。