2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒトネフローゼ発症に関わるBMPファミリー下流経路の解析
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15K09245
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
野入 英世 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (00301820)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | floxed mice / ターゲットリシークエンス / inhibitor of DNA binding |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究チームでは，近年全ゲノム解析によりrs16946160の一塩基多型（SNP）が成人のネフローゼ症候群発症に関わることを報告した．糸球体上皮細胞のGPC5の発現レベルに関与し，蛋白尿発症強度を制御していることを示した．これにより，機能的なヘパラン硫酸制御への国内外の専門家の関心が一機に膨らんでいる．本研究成果の中で，ヘパラン硫酸のグリコサミノグリカンを制御する酵素として知られているサルファターゼ（SULF）の機能不全が，蛋白尿発症強度を変える可能性が標識SNPのrs11086243により示唆された．そこで，本研究提案に先立つ科研費基盤研究（B）において，この領域に関わる詳細な解析を行い，発症に関わるハプロタイプをSULF, PREX1間で同定した．SULF2/PREX1領域のターゲットリシークエンスを，Ion Proton用にAmpliSeq Custom Panel作成（IAD68525_188）し， Case (n=14) Control (n=14)で行った．各症例より取得したvariant（おそらく，一検体あたり1,000以上はあり）を症例毎にファイルとする作業を経て，common variantよりLD構造を決定し，機能的なrare variantの絞り込みへと進んでいる．
培養糸球体上皮細胞を用いた検討より，BMP6下流のシグナルとしてSmad1/5/8, p38, ERK1/2のリン酸化を通して，inhibitor of DNA binding 1-3(Id1-3)の発現が修飾されることがわかりつつある．特にId1への影響が大きいと考えて，floxed-Id1マウスを作製し確認が終了した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
【Common variantについて】1000 genomes（Total）をreferenceにして，研究チームがこれまでに実施済みのFine mapping data（約30 SNPs, case 200 vs. ctrl 300）を利用したimputationを，現在実施している．【Rare variantについて】ion Protonにて，データベースに未登録で機能的に重要そうなrare variantを検出したため，これらのvariantのvalidationを，sanger sequencerを用いて実施している．
研究チームの保有するpodocine-CreERTを用いた糸球体上皮細胞特異的遺伝子欠損の効果を検討する遺伝子としてId1を決定した．更にId1のfloxed化に成功した．
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| Strategy for Future Research Activity |
SULF2/PREX1領域のターゲットリシークエンスにより得られたCommon variant及びRare variantについての解析を引き続き行い，ハプロ解析の結果より強く発症に関わる領域が見いだせるかを詰める．次に，podocine-CreERT及びfloxed-Id1の交配を開始しており，今後タモキシフェンによる誘導下でネフローゼマウスモデルによる検討を実施する予定である．
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| Causes of Carryover |
SULF2/PREX1領域のターゲットリシークエンスにより得た情報をもとに，common variantよりLD構造を決定し，機能的なrare variantの絞り込みへと進む段階となった．
BMP6の下流の解析を行って，Id1の関与が示唆されたたため，floxed-Id1 mice作製を試みて成功した．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
【Common variantについて】imputationにて関連が強いCommon variants（例：Top 10 SNP）について，ion Proton data（n = 14）と比較して確認することを経て，OkならTaqManで，case 200 vs. ctrl 300の実タイピングを実施する． 【Rare variantについて】sanger sequencerのデータを確認のうえ，TaqManで，case 200 vs. ctrl 300の実タイピングを実施する．
podocin-CreERTとfloxed-Id1の掛け合わせによって作出したF1マウスを用いて，これまでに確立したマウスネフローゼモデルを活用し，機能解析を血液及び尿生化学的指標や組織学的評価，分子生物学的評価を駆使しして実施する．
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[Journal Article] Glypican-5 Increases Susceptibility to Nephrotic Damage in Diabetic Kidney.2015
Author(s)
Okamoto K, Honda K, Doi K, Ishizu T, Katagiri D, Wada T, Tomita K, Ohtake T, Kaneko T, Kobayashi S, Nangaku M, Tokunaga K, Noiri E
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Journal Title
Am J Pathol
Volume: 185
Pages: 1989 - 1998
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
