2015 Fiscal Year Research-status Report
患者由来iPS細胞の腎分化系を用いたARPKDの病態モデル作製
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15K09258
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
長船 健二 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (80502947)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 腎臓 / 中間中胚葉 / 尿管芽 / 集合管 / ARPKD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腎臓に進行性に多数の嚢胞を形成し腎機能不全を引き起こす、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)や常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)などの嚢胞性腎疾患の病態機序の解明や根治的治療薬の開発研究の進展が期待されている。また、難治性疾患の患者体細胞から樹立される疾患特異的iPS細胞を病気で傷害される細胞種に分化誘導することによって病態を再現する疾患モデルを作製する研究が盛んに行われている。本研究では、特にARPKDに着目し、ヒトiPS細胞から同疾患で傷害される腎細胞種である胎生期腎臓の尿管芽細胞とそれより派生する集合管細胞への高効率分化誘導法を確立する。そして、ARPKD患者由来iPS細胞をそれらの傷害腎細胞種へ分化誘導することによって、ARPKDの腎嚢胞形成を再現する新規の疾患モデルの開発を目指す。最終目標として、新規の治療標的分子となりうる病態関連分子の同定や腎嚢胞形成を模倣する培養系を構築することによって、腎嚢胞形成を阻害する治療薬のスクリーニング系開発に繋げる。
平成27年度は、前年度までに開発した低効率のヒトiPS細胞から中腎管細胞を経た尿管芽細胞への分化誘導における増殖因子の組み合わせ、濃度、タイミング、処理期間のさらなる検討を行うことで、高効率な尿管芽細胞の分化誘導法を確立し、マウス胎児の後腎間葉との共培養などの機能試験を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ARPKDなどの嚢胞性腎疾患に対する疾患モデル作製のためには、ヒトiPS細胞から中間中胚葉、中腎管を経て尿管芽を選択的に分化誘導することが重要である。申請者らは、本研究開始までに尿管芽細胞を40%程度の効率にて分化誘導する方法を開発していた。その培養法においては、中間中胚葉および尿管芽の前段階である中腎管細胞までは二次元の平面培養であるが、その後に、細胞塊を形成し三次元培養を行うことが必要であるため分化誘導効率が高くなく、その改良により分化誘導効率を向上させることを目標に掲げ研究を実施した。
研究開始当初、中腎管から尿管芽細胞への誘導効率を向上させるため、このステップを二次元培養に改良することをさまざまな増殖因子の組み合わせ処理を行って検討したが誘導効率は改善しなかった。そのため、その他の原因を検討したところ、最初の原始線条を誘導するステップにおいて中内胚葉である原始線条に加えて外胚葉の細胞が形成されているためであることが判明した。そして、最初の原始線条を誘導するステップとしてアクチビンとWnt経路の活性化剤であるCHIR99021を用いていたが、外胚葉への誘導を抑えるための増殖因子の組み合わせを複数検討し、外胚葉の混入を減少させる方法を開発したところ尿管芽細胞の誘導効率が80%以上となった。
この尿管芽細胞の誘導効率向上に計画以上の時間を要したため、平成27年度のもう一つの研究プロジェクトである集合管細胞のマーカー遺伝子であるAQP2のレポーターヒトiPS細胞株の樹立が遅れた。レポーター細胞株の樹立のためにCRISPR/Cas9システムを用いることに決定後にターゲティング戦略を考案し、ガイドRNAの設計を完了し現在樹立を続けている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトiPS細胞由来の尿管芽細胞とマウス胎児後腎間葉細胞との間の相互分化誘導作用の有無の確認などの機能解析を進める。AQP2レポーターヒトiPS細胞株の樹立を完了し、尿管芽細胞から集合管細胞への分化誘導法および三次元の集合管構造の作製法の開発を行う。また、AQP2レポーター細胞株を用いて単離される集合管細胞の遺伝子発現解析を行い、集合管細胞を単離するための表面抗原の探索を行う。そして、ARPKD患者由来iPS細胞と対照となる健常iPS細胞を尿管芽細胞と集合管細胞へ分化誘導を行い、それらの細胞種の細胞表面抗原を用いた単離・純化を行い遺伝子発現の比較解析による病態関連分子の探索や病態を形成する発生時期の確定、三次元の集合管構造の作製による嚢胞形成の再現などの病態解析研究を進めていく。そして、ARPKDの新規治療標的分子の同定や治療薬スクリーニング系の構築に繋げていく。
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