次世代シークエンサーを用いた多発性嚢胞腎（ADPKD）の遺伝子診断

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09279
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 望月 俊雄 東京女子医科大学, 医学部, 特任教授 (00277120)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 多発性嚢胞腎 / ADPKD / PKD1 / PKD2 / 遺伝子解析 / 次世代シークエンサー

Outline of Annual Research Achievements

ADPKDにおける早期診断ならびに除外診断ならびにADPKDの新たな治療薬であるバソプレシン受容体拮抗薬（トルバプタン）の適応決定のため、次世代シークエンスにより、迅速で、精度の高い、ADPKD遺伝子診断法を確立することが本研究の目的である。
次世代シークエンスについて、PCRを用いた新たなIon-PGM法（AmpliSeq）を採用するためのPKD1ならびにPKD2遺伝子領域のプライマーを設定し、シークエンスを行った。新たな方法のため、その精度を確認するため、16サンプルで行った。11サンプルで変異を検出したが、キャピラリー・シークエンス法では、7個の変異を確認できた。その内訳は、nonsense mutation (PKD1 exon11）、3つのmissense mutation (PKD1 exon15,15,19）、splicing mutation (PKD2 IVS9）、nonframeshift deletion（6bp） (PKD1 exon36）、frameshift deletion（2bp） (PKD1 exon23）であった。しかし、昨年度行った「ターゲットDNA濃縮法」と同様に、「新たなIon-PGM法（AmpliSeq）」も検出率が低かった。このため、さらなる検出率向上を目的にロングレンジPCRを用いて当該遺伝子領域全体を増幅し、次世代シークエンサーにて解析することとした。PKD1領域を6個のロングレンジPCR、PKD2領域を5個のロングレンジPCRでカバーし、網羅した。予備実験では、PKD1、PKD2ともにエクソン1はGCリッチな領域のため、ややカベレージが低い傾向にあったが、概ね両遺伝子領域をカバーすることができることを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

次世代シークエンサーの技術革新により、「新たなIon-PGM法（AmpliSeq）」を採用したが、それでも精度向上にはならず、最終的にロングレンジPCRを用いた方法を採用することにしたため。

Strategy for Future Research Activity

次世代シークエンスについて、ロングレンジPCRを用いて行っていく。予備実験を重ねて行っており、最終年度でのPKD遺伝子診断法の確立を目指す。さらに、その結果をふまえて日本人ADPKD患者における遺伝子変異のタイプ、頻度ならびに遺伝子型と表現型の相関（genotype-phenotype relationship）についても検討する。遺伝子変異と臨床的重症度（末期腎不全年齢など）との遺伝子型・表現型の相関性についての解析も行う。

Causes of Carryover

当初予定していた次世代シークエンスが思うように機能せず、先送りになっているため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

ロングレンジPCRにかかる費用ならびに次世代シークエンス費用に充てる。