2015 Fiscal Year Research-status Report
アクアポリン２の尿中排泄のメカニズムと生理学的役割の解明
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15K09301
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
佐々木 成 明治薬科大学, 薬学部, 研究員 (60170677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 靖子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (20386452)
石橋 賢一 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (80223022)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アクアポリン / 尿濃縮 / 腎臓 / 水電解質 / バソプレシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アクアポリン-2 (AQP2)は尿濃縮を司る腎臓の水チャネル蛋白質であり尿中へ排泄され、疾患マーカーとして期待されている。しかしその詳しい分泌動態や生理的意義は不明である。ヒト健常人の尿とヒトAQP2発現培養細胞を用いて研究を行い、以下の結果を得た。
１。尿AQP2の大部分は細胞外小胞(EV)に存在する: ヒト尿AQP2 ELISAキットを使用して、原尿、3000g遠心後、200,000g遠心後の尿AQP2濃度を測定したところ、3000gで沈殿する細胞断片などには1.5%しか存在せず、200,000gで沈殿する膜分画に98%以上が存在していた。この膜分画はWestern blotでAQP2, TSG101, ALIX, b-actin, ENaC, CD9, CD63が認められ、EVであることが示された。このEVについて抗AQP2抗体で共免疫沈降を行ったところ、CD9、TSG101の共存を認め、AQP2がexosomeに存在することが確認された。
２。EVの形態： ヒト健常人の尿より超遠心法でEVを分離し、電顕で観察したところ、10-100nmの小胞が多数認められた。この小胞は-25℃とアルカリ処理で破壊され、この結果はELISAでの尿AQP2測定時に、-25℃あるいはアルカリ処理の事前処理が必要なことと一致する。
３。分泌動態： ヒトAQP2の安定発現MDCK細胞を透過性を有する膜（Transwell）に培養すると、アピカル側の培養液にAQP2の分泌が認められた（10倍の濃度較差）。さらに分泌刺激としてForskolin(10nM)あるいは高浸透圧(100mM NaCl)を添加したところ、高浸透圧刺激で有意の上昇が認められた。以上より、尿AQP2のほとんど全てが、尿中のexosomeに排出され、高浸透圧刺激に反応性であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通りに進行している。Exosomeを破壊する方法が見つかったので、抗AQP2抗体による共免疫沈降が可能となり、網羅的蛋白解析が進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．AQP2を多く含むヒトの尿中エキソソームの性質をについて、共存蛋白の網羅的解析を行い、他のエキソソーム（具体的にはCD9で免疫沈降したもの）と比較することにより特性を明らかにする。
２．昨年度は永続的にAQP2を強制発現する細胞を使用したが、今年度はより生理的でバソプレシン刺激に反応性があるmpkCCD細胞で実験を行う。特にバソプレシン投与により、AQP2のアピカル膜への移動が起こる短期間（３０分以内）で分泌増加が起こるかを明らかにする。浸透圧刺激との差異も検討する。また、エクソソームの形成阻害剤を投与し、阻害前後でバソプレシン刺激を行い、AQP2の細胞内動態の変化を調べる。
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| Causes of Carryover |
研究は計画に従って順調に進展しており、予算使用も予定通りであった。生じた差額は総額の1％以下の10,561円と軽微であった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度も当初の予定通りに研究を進め、今年度の差額10,561円は物品費に充てる予定である。
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[Journal Article] Urinary excretion of the water channel aquaporin 2 correlated with the pharmacological effect of tolvaptan in cirrhotic patients with ascites2016
Author(s)
Nakanishi H, Kurosaki M, Hosokawa T, Takahashi Y, Itakura J, Suzuki S, Yasui Y, Tamaki N, Nakakuki N, Takada H, Higuchi M, Komiyama Y, Yoshida T, Takaura K, Hayashi T, Kuwabara K, Sasaki S, Izumi N
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Journal Title
Gastroenterol. 2015 Nov 26. [Epub ahead of print]
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Urine Aquaporin-2: Improvement in ELISA Measurements by alkali pre-treatment and mechanisms of the secretion2015
Author(s)
Sei Sasaki, Saijo Y, Ohmoto Y, Iwata F, Koga D, Shimada T, Sakai M, Takahashi Y, Tanaka Y, Ishibashi K, Katsuragi K
Organizer
アメリカ腎臓学会
Place of Presentation
サンディエゴ （アメリカ）
Year and Date
2015-11-07
Int'l Joint Research
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