アデノシンA2a受容体ノックアウトによるα-シヌクレイン神経毒性緩和機序の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09308
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 荒若 繁樹 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00344789)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: パーキンソン病 / αシヌクレイン / アデノシンA2a受容体 / アデノ随伴ウイルス / 動物モデル / 神経変性 / 神経病態

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題は、パーキンソン病治療におけるアデノシンA2a受容体抑制の神経保護作用を明らかにすることを目的としている。方法として、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウス脳の中脳黒質にアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いてα-シヌクレインを発現させることにより、α‐シヌクレインによって惹起されるドパミン神経細胞変性および炎症細胞の集簇に対するアデノシンA2a受容体抑制の効果を解析する。はじめに、アデノシンA2a受容体ノックアウトマウスをC57BL/6系統のマウスと交配を繰り返し、コントロールの野生型マウスと系統を揃えた。並行して、より目的遺伝子を高発現させるため、アデノ随伴ウイルスを血清型９に変換する作業を行った。作製したAAVをアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスおよびコントロールマウスに接種し、接種後２、４、８週間後に脳を採取した。採取した脳の浮遊切片を作製し、α‐シヌクレインに対する抗体を用いて免疫染色を行い、α‐シヌクレインが適切に黒質緻密部で発現されているか確認した。ウイルス接種が適切と判断され、α‐シヌクレインの発現も適当と判断される脳組織を抽出した。得られた脳組織をチロシン水酸化酵素に対する抗体で免疫染色し、残存するドパミン神経細胞数をステレオロジーシステムで定量的に計測している。また、アストロサイトなどに対する抗体で免疫染色を行い、グリア細胞の集簇の変化について解析を行っている。現在、得られたデータの評価作業を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

AAVを用いて目的遺伝子を脳に発現させる場合、目的とした部位にウイルスが接種され、適切な範囲に拡散している必要がある。本研究では、中脳の黒質緻密部という非常に小さな領域に発現させなくてはならない。加えて、マウスを対象としているため、脳が小さく、局所発現の技術的な難易度が高い。そのため、接種したマウスは個々に脳組織をα‐シヌクレインに対する抗体で免疫染色し、発現している部位および発現程度を評価しなくてはならない。実験では、中脳黒質におけるα‐シヌクレインの発現が、適切ではないと判定されたものが予想よりやや多かった。α‐シヌクレインの発現によって惹起されるドパミン神経細胞の脱落に対するアデノシンA2a受容体の効果を評価するために、AAV接種する個体数をノックアウトおよび野生型マウスで増やす作業が必要となった。そのため、解析作業にやや遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

現在、AAVをアデノシンA2a受容体ノックアウトマウスおよび野生型マウスに接種し、接種後２、４、８週間後に採取した脳について、残存するドパミン神経細胞数およびミクログリア・アストロサイト集簇の変化について解析を行っている。解析結果をまとめ総括し、結果を公表できるよう作業を進めていく予定である。

Causes of Carryover

ウイルスの準備および接種に予想以上の時間を要したため、解析に必要な個体数を確保するのに時間がかかった。そのため、解析作業に移行するのに遅れが生じた。これらの解析を行うために、残る経費を物品費として使用する計画である。また、論文作成に向けた情報収集のため日本神経学会（２０１８年５月札幌）総会出席の旅費として使用する予定である。