2016 Fiscal Year Research-status Report
αシヌクレイン凝集体形成とリソファジーを標的とする病態伝播と神経細胞死の回避
| Project/Area Number |
15K09321
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
辻村 敦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50236890)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60462701)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | αシヌクレイン / リソソーム / オートファジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
神経変性疾患であるパーキンソン病の発症機序や治療アプローチの探索を検討する上で最も重要であるαシヌクレインの動態を検討する中で、αシヌクレインの細胞内凝集体形成にはリソソームによる部分分解などの修飾プロセスが必要であることを発見し、その病理的分子の実態とその毒性発揮のメカニズムの解明を目指している。試験管内で単量体αシヌクレインから作成したフィブリルを細胞導入試薬を用いてαシヌクレイン-EGFP融合蛋白質を発現する培養細胞に導入し細胞内凝集体形成と細胞毒性の相関を調べた。外来フィブリルによる細胞内凝集形成は細胞毒性を引き起こし、凝集の導入細胞内凝集の形成が細胞毒性の引き金になっていることは確かである。さらに細胞毒性を引き起こす過程を調べるため、CRISPRによりオートファジー遺伝子ノックアウト細胞株を作成して同様の実験を行うと、細胞内凝集体形成は増加するにもかかわらず、細胞毒性は非常に抑制される現象が観察された。これは本研究の主な着眼点である、リソファジー連鎖による細胞毒性出現を反映しているものと思われる。毒性を示す病的シヌクレインの分子種の特定のため野生型、オートファジー欠損細胞株間でのシヌクレイン凝集の差異を追跡し分子種の特定を進める予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
αシヌクレイン凝集体特異的なの細胞受容体LAG3に関する報告があり（Mao X, et.al Science. 2016 Sep 30;353(6307))、我々の実験系でのLAG3が機能しているかどうかの検証を優先して行った。また学会発表において、細胞導入試薬による細胞障害の可能性を指摘され、導入試薬を用いない凝集シード導入法の検討も必要となりその検討に時間をとったためため研究の進行が少し遅れることとなった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
細胞内凝集体形成の過程を解析するために用いているHela, HEK293, SH-SY5Yなどの培養細胞以外に、より生体に近い初代培養神経細胞などを用いたアッセイ系とを並行して実験を行い、細胞毒性を示す分子種のより正確な特定を行う予定である。
|
| Causes of Carryover |
初年度において超音波破砕機を使用しないプロトコルに変更したため使用額が減少し次年度へと繰越となっている。またアッセイキットを用いた実験のスケールがより小さく削減可能であったため消費量が少なくなり購入が減少したため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
初代培養系神経細胞を使ったアッセイ系を増やし、より生体に近い条件下での実験を増やすための培養用試薬の購入に充てる。
|
