2016 Fiscal Year Research-status Report
受容体結合活性に基づくグルカゴン測定法によって糖尿病を再検証する。
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15K09373
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
藤田 征弘 旭川医科大学, 医学部, 助教 (20451461)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | グルカゴン / 膵島 / 測定法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵島α細胞と分泌ホルモンであるグルカゴンが、糖代謝のkey modulatorとして再注目されている。α細胞の研究には、生理的培養細胞株がないことや測定法の交差性など課題が多い。本研究の目的として、受容体結合に基づくバイオアッセイ法を確立し、糖尿病状態でのグルカゴン分泌を再検証する。加えて糖尿病状態でのα細胞の数量的・機能的異常や増殖能亢進のメカニズムの機序を探究する。
我々の研究室では、グルカゴン、GIP、GLP-1各受容体とそのシグナル下流のcAMP量に反応し、ルシフェラーゼを発現する（Luc-Cre）を共発現する培養細胞(HEK293)を確立している。昨年の報告でグルカゴン受容体のアッセイではGIPやGLP-1によって受容体活性が活性化されないことを報告したが、追加検討でプログルカゴン遺伝子産物のオキシントモデュリンがかなりグルカゴンと同じぐらいの受容体刺激活性を持つことが明らかになった。
次に正常耐糖能者(n=6)および、２型糖尿病患者（n=4, age: 64.3±12.6 years, BMI: 24.3±3.2 kg/m2）にミール負荷試験（MTT)を行った。なお２型糖尿病患者においては、DPP-4阻害薬服用前後で２回のMTTを施行した。MTTにはクッキーミール（ 592 kcal, carbohydrate 75 g, protein 8.0 g, fat 28.5 g）を用いた。グルカゴン測定には、市販されているELISAキットも使用し比較検討した。まず、正常耐糖能患者に比較して、２型糖尿病患者では、バイオアッセイ法では高値であることが確認できた。さらに２型糖尿病患者において、バイオアッセイ測定によるグルカゴンのincremental AUC (iAUC0-120 min) は、DPP-4阻害薬内服で優位に低下することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
正常耐糖能者や入院2型糖尿病患者にミールテストを行い、バイオアッセイによるインクレチン測定とともにグルカゴン測定も測定しており、学会発表の予定である。
また外来患者においては、正常耐糖能者、耐糖能異常者、２型糖尿病患者をリクルートしてミール負荷試験をすで十分数の対象者に施行している。現在、各アッセイについて逐次測定中である。
一方、グルカゴン産生細胞の詳細な検討を行うため、グルカゴンプロモーター下に蛍光タンパクのYFPを発現するマウスを飼育しているが、現在実験に十分数のホモ接合体のマウスを維持飼育している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）正常状態、糖尿病状態における膵外からのグルカゴンの役割を探究する
消化管粘膜からえられたYFP陽性細胞を初代培養し、さまざまなブドウ糖、アミノ酸、インスリン，インクレチンの濃度の条件で、培養液や細胞抽出液を回収してグルカゴン受容体活性化能に基づいた測定法で測定する。糖尿病状態での変化を、mGluVenus-STZ マウスまたはmGluVenusをAkitaマウスなど自然発症マウスに交配し、上記の方法で検討する。
２）糖尿病状態のおけるα細胞の機能的異常や増殖能亢進のメカニズムを探究する。
mGluVenus-STZマウスよりYFP陽性α細胞を回収し、RNAを抽出し、遺伝子発現の変化をmicroarray法で網羅的に解析する。グルカゴン遺伝子の転写にかかわる転写因子(MafB、Arx、PAX6)やプロセッシングに関わる因子(PC2、PC1/3)、細胞周期にかかわる因子(Cyclin D)を中心に解明する。また、α細胞の質的な変化、PC1/3発現によるGLP-1やGIP産生がどのようなシグナルで起こるか検討する
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| Causes of Carryover |
一部、他の研究資金を利用したため。
結果として、物品費の使用額が減った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後、抗体の購入、糖尿病モデルマウスなど動物の購入に充てる予定。
さらに、遺伝子発現の網羅的解析に費用がかかるため、十分に使用することが可能である。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor treatment induces a greater increase in plasma levels of bioactive GIP than GLP-1 in non-diabetic subjects2017
Author(s)
Tsuyoshi Yanagimachi , Yukihiro Fujita, Yasutaka Takeda , Jun Honjo, Hidemitsu Sakagami, Hiroya Kitsunai, Yumi Takiyama, Atsuko Abiko, Yuichi Makino, Tomothy J. Kieffer, Masakazu Haneda
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Journal Title
MOLECULAR METABOLISM
Volume: 6
Pages: 226-221
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
