網羅的抗体解析を用いた劇症１型糖尿病早期診断のための特異的血清マーカーの開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09402
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 花房 俊昭 大阪医科大学, 名誉教授 (60164886)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐野 寛行 大阪医科大学, 医学部, 助教 (20556435)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 劇症1型糖尿病 / Ｓｅｒｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ / 抗ＣＤ３００e抗体

Outline of Annual Research Achievements

私共は劇症1型糖尿病の特異的診断マーカーの作成を目的とし、3名の劇症1型糖尿病患者血清 (急性期と亜急性期)を用いて約9000種類以上のSeromic analysisを行い、急性期血清において上昇を認めた9つの抗体を明らかにした。この9つの抗体から、抗CD300e抗体(特許申請中)と抗LGALS3抗体の2つの抗体に着目した。各抗体価測定用ELISAキットを作成し、劇症1型糖尿病患者の急性期30名、亜急性期30名、慢性期14名、自己免疫性1型糖尿病患者30名、2型糖尿病患者30名、自己免疫性甲状腺疾患患者20名、健常者31名を対象とし、抗体価の測定をし終えた。その結果、抗300e抗体価は劇症1型糖尿病急性期において、劇症1型糖尿病慢性期、他の疾患、健常者と比較して有意に高値を示した。また、同一患者において、劇症1型糖尿病急性期の抗CD300e抗体価は、亜急性期と比較して有意に高値を示した。抗LGALS3抗体価は、自己免疫性1型糖尿病患者において、2型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、健常者と比較して有意に高値を示した。

本年度、ELISA法にて測定した抗CD300e抗体価の特異性検討をおこなった。
CD300e遺伝子をトランスフェクションしたHEK293細胞(CD300e+ HEK293細胞)を、劇症1型糖尿病患者急性期および健常者の血清、PE-IgG(2次抗体)と反応させた後、フローサイトメトリーによりPE-CD300e+ HEK293細胞数の測定をおこなった。その結果、劇症1型糖尿病患者急性期の血清と反応させたCD300e+ HEK293細胞において、健常者血清を用いたものより多くのPE-CD300e+ HEK293細胞を確認できた。これらの事実から、ELISA法により測定した抗CD300e抗体価の特異性を証明することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ELISA法にて測定した抗CD300e抗体価の特異性検討に関して、ウエスタンブロット法による確認が困難であり、上記の研究実績の概要に示した通りフローサイトメトリーによる特異性の検討をおこなったため、少し時間を要したが、当研究はおおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

1) ウイルス感染患者(インフルエンザ患者)、他の自己免疫性疾患(関節リウマチ)
患者の血清中抗CD300e抗体をELISA法にて測定する。蛋白CD300eはマクロファージの遊走能やアポトーシス、自己反応性のＴリンパ球の免疫応答に関与することが明らかになっている。従って、現在までの結果で認められた劇症1型糖尿病患者急性期の血清中抗CD300e抗体価の上昇が、劇症1型糖尿病に特異的なものか否かを確認するために、上記の検討をおこなう。
2) 劇症1型糖尿病患者剖検膵組織での抗原蛋白CD300e発現の検討
3) 抗CD300e抗体/抗原蛋白CD300eの機能解析
を当初の計画通り遂行する。

Causes of Carryover

予算の見積もりに若干の誤差が生じたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の予算に加算して、研究の進捗に応じて使用する。

Research Products

• [Journal Article] Antibody to CMRF35-Like Molecule 2, CD300e A Novel Biomarker Detected in Patients with Fulminant Type 1 Diabetes. (2016)
  • Author(s): Haseda F, Imagawa A, Nishikawa H, Mitsui S, Tsutsumi C, Fujisawa R, Sano H, Murase-Mishiba Y, Terasaki J, Sakaguchi S, Hanafusa T.
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 11 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0160576
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant