2016 Fiscal Year Research-status Report
劇症１型糖尿病患者膵より同定された２種のウイルスによるβ細胞傷害機構の解明
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15K09429
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
今川 彰久 大阪医科大学, 医学部, 教授 (80373108)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩橋 博見 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座准教授 (60397627)
福井 健司 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60513009)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | １型糖尿病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．劇症１型糖尿病患者膵組織の収集と新規鍵分子の検証：膵α細胞、膵外分泌細胞にヒトサイトメガロウイルス（HCMV）感染の認められた症例1において、HCMV感染細胞に DAI（DNA ウイルスレセプター）、RIG-I（RNA ウイルスレセプター）の発現を認め、一部のα細胞にもDAI、RIG-Iの発現を認めた。さらにⅠ型IFN産生に必須の転写因子であるIRF3（Interferon regulatory factor 3）が約半数のHCMV陽性細胞とHCMV陽性膵島内の一部のα細胞に発現していた。また、新たに収集した1例（症例3）では非膵島領域にHCMV感染細胞、HHV-6感染細胞を認めたが、EBV感染細胞、エンテロウイルス感染細胞は認めなかった。
２．劇症1型糖尿病におけるin vitro治療モデルの確立：前年度に健常人由来iPS細胞より分化誘導して得られたインスリン陽性細胞にpoly I;Cをトランスフェクションすることでアポトーシスが亢進し、Exendin 4により抑制される劇症1型糖尿病の治療モデルの一部を確立していた。しかしISG15によるモデルの構築は達成できなかった。
３．iPS細胞由来インスリン産生細胞を用いた新規鍵分子の同定：劇症1型糖尿病患者由来iPS細胞より分化誘導して得られたインスリン陽性細胞においてウイルス感染時に上昇することが確認されている炎症性サイトカインを投与したところ、アポトーシス（活性型カスパーゼ3陽性細胞）の亢進と抗ウイルス遺伝子（CH25H）の発現低下が明らかになり、CH25Hは劇症１型糖尿病治療における新たな鍵分子であることが示唆された。さらにCH25Hの機能解析を進め、MIN6に炎症性サイトカインを投与することで上昇したカスパーゼ3活性が、25 Hydroxylaseの投与で減少することなどを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２８年度の計画では、１）劇症１型糖尿病患者膵組織における新規鍵分子の検証とin vitro 治療モデルの確立、２）iPS細胞を用いた鍵分子同定とβ細胞障害抑制モデルの構築、３）劇症１型糖尿病膵組織のウイルス学的解析、４）ISG15によるβ細胞傷害抑制モデルの検討を予定していた。
このうち、１）についてはDAI、RIG-I、IRF3といった鍵分子を次々に明らかにした。これらの分子を用いたin vitro 治療モデルの確立には至っていないが、計画は概ね順調に進捗している。２）については、新たな鍵分子としてCH25Hを同定し、機能解析を進め、β細胞傷害抑制モデルを構築しつつある。３）についても新たな症例でウイルス感染を明らかにしている。また、これらの結果の一部は、第59回日本糖尿病学会年次学術集会（京都、2016）にて報告した。
本年度は１）２）３）を重点的に検討したため、４）は大きな進展は得られていないが、本研究は全体として概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに、１）劇症１型糖尿病患者膵組織の解析と２）iPS細胞由来インスリン産生細胞を用いた新規鍵分子の同定の２項目において、特に進展が得られたので、今年度はこれらに重点をおいて研究代表者のもと、研究分担者、大学院生やポスドクを組織して推進していく。
１．劇症１型糖尿病患者膵組織の収集と新規鍵分子の検証：膵組織の収集を引き続き行ない、本年度までに明らかにされた鍵分子、ウイルス等の発現についてさらに検討を進める。特に、HCMV感染の認められた症例ではHCMV陽性膵島に浸潤するCD8陽性Tリンパ球が、HCMV特異的なものであるかについて、MHCテトラマーキットを用いて検討する。
２．新規鍵分子CH25Hの機能解析： MIN6細胞を用いてCH25Hの機能解析を進める。まず、siRNAを用いてch25h発現をknockdownさせた状態でサイトカインを投与し、今までの結果と合わせてCH25Hがこれらのことから膵β細胞におけるアポトーシスに対してCH25Hは保護的に作用していることを明らかにする。また、CH25H遺伝子の一塩基多型（SNP）を劇症1型糖尿病患者および健常人と比較することで疾患関連SNPを同定する。さらに患者および健常者末梢血中の25 Hydroxylaseを測定することで、本遺伝子と劇症1型糖尿病発症との関係を検討する。
３．iPS細胞由来インスリン産生細胞を用いた新規鍵分子の同定：劇症１型糖尿病iPS細胞由来インスリン陽性細胞にサイトカインを投与することで病態を模倣し、RNAシークエンスを実施し、CH25Hの存在を明らかにした際に、他にいくつかのアポトーシス関連遺伝子発現の上昇・低下を確認している。これらの遺伝子をMIN6細胞においてノックダウンもしくは過剰発現することで、劇症１型糖尿病発症に関係するさらなる新規鍵遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
当初の計画の手順を一部修正し、次年度に使用する予定が生じたため、次年度使用額が生じた。すなわち、平成29年度に幹細胞培養を含む細胞培養に関する研究を重点とした計画に修正したためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
幹細胞培養を含む細胞培養に関する費用、サイトカイン等測定キット購入費用、FACSおよび免疫組織化学に使用する抗体と染色キット、遺伝子発現量測定のためのキット、DNA抽出と塩基配列同定のためのキット購入費用など、計画にしたがって研究費を使用する。
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Research Products
(5 results)
