正常造血及びMPN発症におけるCalreticulinの役割解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09480
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 北中 明 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (70343308)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 幣 光太郎 宮崎大学, 医学部, 助教 (20468028)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 骨髄増殖性腫瘍 / シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

骨髄増殖性腫瘍（MPN）のうち、本態性血小板血症（ET）および原発性骨髄線維症（PMF）患者の約3割に変異が認められるCalreticulin(CALR)について、野生型CALRの正常造血における役割、ならびに変異型CALRのMPN発症における役割を明らかにするため、以下のテーマについて研究を実施している。
1）変異CALRのin vitro機能解析： 細胞表面にトロンボポエチン（TPO）受容体であるMPLを発現し、巨核球の形質を有するヒト細胞株を対象に、CRISPR/Cas9システムを用いてヒトと相同的なCALR変異のノックインを行い、2種類の細胞株（CMK11-5, F36P-MPL）について安定なトランスフォーマントを得た。CALR変異導入CMK11-5細胞では、親株に比して、細胞増殖、TPO感受性の亢進が認められた。F36P-MPLは、本来GM-CSFおよびIL-3に依存性の増殖を示す細胞株であるが、CALR変異の導入によって増殖に関するサイトカイン依存性が消失した。
2）正常CALR及び変異CALRのin vivo機能解析：CALR遺伝子のfloxマウス, KOマウスと血球特異的Cre-recombinaseを誘導できるMx-Creマウスを交配し、Mx-Cre, CALRflox/-マウスを作成した。この二重変異マウスではpIpCを投与により、血球特異的なCALR発現欠損が認められている。また、野生型マウス骨髄細胞にレトロウイルスによりCALR変異体を導入し成体マウスに移植したところ、ヒトETの病態を再現するモデルが作成できた。当該モデルマウスが示すMPN病態の制御に、JAK2阻害剤ルキソリチニブの投与が有効であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの研究により、変異CALRの機能解析について、in vitro、in vivo両方のモデルが作成できた。in vitroモデルを用いた解析から、変異CALRがリガンド非依存性にJAK-STAT系の活性化を引き起こし、サイトカイン依存性細胞株（F36P-MPL）に対してサイトカイン非依存的な増殖能を獲得させることが明らかとなった。また、変異CALRによるJAK-STAT系の活性化には、細胞にTPO 受容体であるMPLの発現が必要であり、G-CSF受容体やEPO受容体の共発現ではJAK-STAT系を活性化できないことが明らかとなった。変異CALRのin vivo機能解析目的で作成したCALR変異体導入マウスは、血小板数が有意に増加するが白血球および赤血球の増加は伴わない、骨髄において特徴的な形態の巨核球が出現するなどヒトETの病態をよく再現していた。このことはCALR変異体の発現のみでマウスにMPNを発症させることが可能であることを示している。CALR変異体導入マウスに対するJAK2阻害剤ルキソリチニブの投与が病勢の緩和に有効であることは、変異CALRによって引き起こされるJAK-STAT系の活性化を制御することが有効な治療手段であることを示している。また、当該マウスはETに対する新規治療の開発モデルとしても有用であると考えられる。現在、血球特異的なCALR発現欠損マウスを用いて正常造血における野生型CALRのin vivo機能解析を継続中である。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までの計画に従って研究を実施した結果、平成28年度にこれまでの成果を論文として公表することができた。今年度は解析を継続中である正常CALRのin vivo機能解析モデルに関する研究を推進する。また、これまでの研究過程で樹立したCALR変異導入細胞株を用いることによって、in vitroの系ではサンプル量の制約を受けずに研究を遂行することが可能となった。当該細胞株を用いてCALR変異体からのシグナル伝達経路に関して詳細な解析を実施していく。

Research Products

• [Journal Article] Calreticulin mutant mice develop essential thrombocythemia that is ameliorated by the JAK inhibitor ruxolitinib. (2017)
  • Author(s): Shide K, Kameda T, Yamaji T, Sekine M, Inada N, Kamiunten A, Akizuki K, Nakamura K, Hidaka T, Kubuki Y, Shimoda H, Kitanaka A, Honda A, Sawaguchi A, Abe H, Miike T, Iwakiri H, Tahara Y, Sueta M, Hasuike S, Yamamoto S, Nagata K, Shimoda K
  • Journal Title: Leukemia Volume: 31 Pages: 1136-1144
  • DOI: 10.1038/leu.2016.308.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differences in Hematological and Clinical Features Between Essential Thrombocythemia Cases With JAK2- or CALR-Mutations. (2017)
  • Author(s): Kubuki Y, Shide K, Kameda T, Yamaji T, Sekine M, Kamiunten A, Akizuki K, Shimoda H, Tahira Y, Nakamura K, Abe H, Miike T, Iwakiri H, Tahara Y, Sueta M, Hashimoto K, Yamamoto S, Hasuike S, Hidaka T, Nagata K, Kitanaka A, Shimoda K
  • Journal Title: Ann Lab Med. Volume: 37 Pages: 159-161
  • DOI: 10.3343/alm.2017.37.2.159.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TET2 mutation in diffuse large B-cell lymphoma. (2017)
  • Author(s): Kubuki Y, Yamaji T, Hidaka T, Kameda T, Shide K, Sekine M, Kamiunten A, Akizuki K, Shimoda H, Tahira Y, Nakamura K, Abe H, Miike T, Iwakiri H, Tahara Y, Sueta M, Yamamoto S, Hasuike S, Nagata K, Kitanaka A, Shimoda K.
  • Journal Title: J Clin Exp Hematop. Volume: 56 Pages: 145-149
  • DOI: 10.3960/jslrt.56.145.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Splenic irradiation provides transient palliation for symptomatic splenomegaly associated with primary myelofibrosis: a report on 14 patients. (2016)
  • Author(s): Kitanaka A, Takenaka K, Shide K, Miyamoto T, Kondo T, Ozawa K, Kurokawa M, Akashi K, Shimoda K.
  • Journal Title: Int J Hematol. Volume: 103 Pages: 423-428
  • DOI: 10.1007/s12185-016-1940-3.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aberrant PD-L1 expression through 3'-UTR disruption in multiple cancers. (2016)
  • Author(s): Kataoka K, Nagata Y, Kitanaka A, Shiraishi Y, Shimamura T, Yasunaga J, Totoki Y, Chiba K, Sato-Otsubo A, Nagae G, Ishii R, Muto S, Kotani S, Watatani Y, Takeda J, Sanada M, Tanaka H, Suzuki H, Sato Y, Shiozawa Y, Yoshizato T, Yoshida K, Makishima H, Iwanaga M, Ma G, Nosaka K, Hishizawa M, Itonaga H, et al.
  • Journal Title: Nature Volume: 534 Pages: 402-406
  • DOI: 10.1038/nature18294.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] All-trans retinoic acid and interferon-α increase CD38 expression on adult T-cell leukemia cells and sensitize them to T cells bearing anti-CD38 chimeric antigen receptors. (2016)
  • Author(s): Mihara K, Yoshida T, Ishida S, Takei Y, Kitanaka A, Shimoda K, Morishita K, Takihara Y, Ichinohe T
  • Journal Title: Blood Cancer J. Volume: 6 Pages: e421
  • DOI: 10.1038/bcj.2016.30.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Physiological Expression of Calr Mutant Increases Cell Growth and Cytokine Independency in Human Cell Lines Expressing Mpl, and Develops Essential Thrombocythemia in Mice. (2016)
  • Author(s): Shine K, Kameda T, Sekine M, Kamiunten A, Akizuki K, Tahira Y, Hidaka T, Kabuki Y, Honda A, Sawaguchi A, Kitanaka A, Shimoda K
  • Organizer: 58th ASH Annual Meeting & Exposition
  • Place of Presentation: San Diego (USA)
  • Year and Date: 2016-12-05 – 2016-12-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CALRdel52 mutation activates the JAK-STAT pathway in coordination with MPL, and causes ET in mice. (2016)
  • Author(s): Shide k, Kameda t, Sekine M, Kamiunten A, Akizuki K, Tahira Y, Shimoda H, Hidaka T, Kubuki Y, Honda A, Kitanaka A, Shimoda K
  • Organizer: 第78回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-15 – 2016-10-15