免疫抑制的腫瘍微小環境を打破する遺伝子導入Tリンパ球の開発とその機能解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09497
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 寺倉 精太郎 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (40625141)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: キメラ抗原レセプター / 遺伝子導入T細胞療法 / CD8陽性 / Tリンパ球 / 腫瘍微小環境

Outline of Annual Research Achievements

1.PD-L1に対するchimeric signaling receptor (PD-L1-CSR)の開発および機能解析:
PD-L1に対する抗体のアミノ酸配列情報をもとに単鎖抗体可変領域をデザインし、細胞内ドメインとしてCD28/41BB/その両方をもつ分子を作成した。これらをレトロウイルスを用いて遺伝子導入を行った。この抗体はPD-L1分子を蛍光標識して染色すると、良好に染色されることから、抗原ときちんと結合することが分かった。In vitro/in vivoにおける効果を今後検討していく。
2．CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発
T リンパ球においてCTLA-4 をKO するため、当初レンチウイルスベースのシステムの開発を試みたが、遺伝子導入時の細胞傷害性が強く発現しうまくいかなかった。そこでCas9 protein systemを用いてCTLA-4を標的として実験を進めた。現在CTLA-4 KO が可能であることを示すため、Cas9 proteinを作用させたあとに細胞を再刺激してCTLA-4発現が低下しているかどうか検討している。作成されたCTLA-4 KO/CD19CAR-T リンパ球あるいはCTLA-4 KO/TCR 遺伝子導入T リンパ球を用いて、in vitro およびin vivo においてこれら細胞のCTLA-4 KO の効果を今後検討する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.PD-L1-CSRの開発および機能解析
目的とする分子の作成は可能であった。今後CSRの機能解析を行うためには、TCRあるいはCARと共発現させたうえで、細胞刺激を行い、その上でシグナルを検討する必要がある。そのため現在CARを遺伝子導入したあと、CSR分子を発現させる系を作成している。
2.CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発
CTLA-4 KOはCas9 protein systemを用いて行うことによって可能であった。現在遺伝子KOの効率を検討している。遺伝子導入効率としては、CTLA-4発現のフローサイトメトリーによる検討の他に、遺伝子の切断を分子学的に検討する。

Strategy for Future Research Activity

1.PD-L1-CSRの開発および機能解析
CARとの共発現の系で検討を進める予定としているが、CAR→CSRの順に遺伝子導入し、効率よく純化するために、これまで用いてきたEGFRの遺伝子マーカーに加えて、もう一種類CD20を遺伝子マーカーとして用意するために準備を進めている。CD20とEGFRの2つの遺伝子導入マーカーを用いて順に純化することによって、高い効率でCAR/CSRの両方が遺伝子導入された細胞を得ることが出来る。あるいはどれだけ遺伝子導入されているか明らかになった細胞で実験を進めることが出来る。標的細胞としてもともとPD-L1陰性の細胞株にPD-L1を遺伝子導入して準備する。これを用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。
2.CTLA-4 knock-out (KO) Tリンパ球の開発
現在行っている実験において遺伝子KO効率が十分高いことが分かれば、その上でそれらの細胞を用いてin vitro/ in vivoの実験を進める。具体的には繰り返し刺激後の反応の減弱の有無について検討する。

Causes of Carryover

PD-L1-CSRの遺伝子導入に加えて、T細胞レセプター（TCR）あるいはキメラ抗原レセプターとの併用において、シグナルを検討する予定としていたが、TCRの遺伝子導入がなかなか進捗しなかったことから、以降の実験に用いるために予定していた抗体や関連の試薬費用が次年度へと持ち越しとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

キメラ抗原レセプター遺伝子の遺伝子導入との組み合わせにおいてPD-L1-CSRを検討することにしたため、遺伝子導入効率や遺伝子導入の効果について以降の実験で検討するため予定していた抗体や関連の試薬費用として使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Comparison of Outcomes of 8/8 and 7/8 Allele-Matched Unrelated Bone Marrow Transplantation and Single-Unit Cord Blood Transplantation in Adults with Acute Leukemia. (2016)
  • Author(s): Terakura S, Atsuta Y, Tsukada N, Kobayashi T, Tanaka M, Kanda J, Najima Y, Fukuda T, Uchida N, Takahashi S, Nagamura-Inoue T, Morishima Y, Miyamura
  • Journal Title: Biol Blood Marrow Transplant. Volume: 22 Pages: 330-338
  • DOI: 10.1016/j.bbmt.2015.10.006.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Integration of humoral and cellular HLA-specific immune responses in cord blood allograft rejection. (2015)
  • Author(s): Hanajiri R, Murata M, Sugimoto K, Murase M, Sakemura R, Goto T, Watanabe K, Imahashi N, Terakura S, Ohashi H, Akatsuka Y, Kurahashi S, Miyamura K, Kiyoi H, Nishida T, Naoe T
  • Journal Title: Bone Marrow Transplant. Volume: 50 Pages: 1187-1194
  • DOI: 10.1038/bmt.2015.119.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cutaneous macrophage infiltration in acute GvHD. (2015)
  • Author(s): Terakura S, Martin PJ, Shulman HM, Storer BE.
  • Journal Title: Bone Marrow Transplant. Volume: 50 Pages: 1135-1137
  • DOI: 10.1038/bmt.2015.114.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chimerism status after unrelated donor bone marrow transplantation with fludarabine-melphalan conditioning is affected by the melphalan dose and is predictive of relapse. (2015)
  • Author(s): Imahashi N, Ohashi H, Terakura S, Miyao K, Sakemura R, Kato T, Sawa M, Yokohata E, Kurahashi S, Ozawa Y, Nishida T, Kiyoi H, Watamoto K, Kohno A, Kasai M, Kato C, Iida H, Naoe T, Miyamura K, Murata M
  • Journal Title: Ann Hematol. Volume: 94 Pages: 1139-1148
  • DOI: 10.1007/s00277-015-2312-4.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 同種造血幹細胞移植後における ドナーT細胞キメリズムと予後との関連に関する検討 (2016)
  • Author(s): 後藤辰徳、寺倉精太郎、 大橋春彦、小山大輔、渡邊慶介、瀬戸愛花、西脇聡史、小澤幸泰、宮尾康太郎、酒村玲央奈、加藤智則、澤正史、 西田徹也、尾関和貴、河野彰夫、飯田浩充、直江知樹、清井仁、宮村耕一、村田誠
  • Organizer: 第38回日本造血細胞移植学会総会
  • Place of Presentation: 愛知県名古屋市 名古屋国際会議場
  • Year and Date: 2016-03-03 – 2016-03-05
• [Presentation] A novel strategy of switching on/off CD19CAR expression under Tetracycline based system (2015)
  • Author(s): 酒村玲央奈、寺倉精太郎、渡邊慶介、宮尾康太郎、小山大輔、後藤辰徳、葉名尻良、西田徹也、村田誠、清井仁
  • Organizer: 57th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Orlando, USA
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] PD-L1 on Antigen-Presenting Cells Facilitate the Induction of Antigen-Specific Cytotoxic T Lymphocytes (2015)
  • Author(s): 後藤辰徳、西田徹也、宮尾康太郎、小山大輔、酒村玲央奈、葉名尻良、渡邊慶介、今橋伸彦、寺倉精太郎、村田誠、清井仁
  • Organizer: 57th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Orlando, USA
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Adoptive transfer of WT1-specific TCR gene-transduced lymphocytes in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia. (2015)
  • Author(s): Tawara I, Masuya M, Kageyama S, Nishida T, Terakura S, Murata M, Fujiwara H, Akatsuka Y, Ikeda H, Miyahara Y, Tomura D, Nukaya I, Takesako K, Emi N, Yasukawa M, Katayama N, Shiku H.
  • Organizer: 57th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Orlando, USA
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Tracking donor-reactive T cell clones by deep sequencing in cord blood allograft rejection (2015)
  • Author(s): 葉名尻良、村田誠、宮尾康太郎、小山大輔、酒村玲央奈、後藤辰徳、渡邊慶介、寺倉精太郎、西田徹也、清井仁
  • Organizer: 第77回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県金沢市 石川県立音楽堂、ANAクラウンプラザホテル金沢、 ホテル日航金沢、ホテル金沢、金沢市アートホール、 もてなしドーム
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-18
• [Presentation] Roles of PD-L1 on antigen-presenting cells for the generation of antigen-specific T cells (2015)
  • Author(s): 後藤辰徳、西田徹也、高木えり奈、宮尾康太郎、小山大輔、酒村玲央奈、葉名尻良、渡邊慶介、今橋伸彦、寺倉 精太郎、村田誠、清井仁
  • Organizer: 第77回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県金沢市 石川県立音楽堂、ANAクラウンプラザホテル金沢、 ホテル日航金沢、ホテル金沢、金沢市アートホール、 もてなしドーム
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-18
• [Presentation] Inducible CD19 CAR expression under tetracycline-based regulation system (2015)
  • Author(s): 酒村玲央奈、寺倉精太郎、渡邊慶介、宮尾康太郎、小山大輔、後藤辰徳、葉名尻良、西田徹也、村田誠、清井仁
  • Organizer: 第77回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県金沢市 石川県立音楽堂、ANAクラウンプラザホテル金沢、 ホテル日航金沢、ホテル金沢、金沢市アートホール、 もてなしドーム
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-18
• [Presentation] A phase I clinical trial of adoptive transfer of WT1 redirected T cells for refractory AML and MDS (2015)
  • Author(s): 藤原 弘、俵 功、谷本 一史、西田 徹也、村田 誠、寺倉 精太郎、糠谷 育衛、赤塚 美樹、岡本 昌隆、桝屋 正浩、池田 裕明、影山 慎一、恵美 宣彦、片山 直之、安川 正貴、珠玖 洋
  • Organizer: 第77回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県金沢市 石川県立音楽堂、ANAクラウンプラザホテル金沢、 ホテル日航金沢、ホテル金沢、金沢市アートホール、 もてなしドーム
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-18
• [Presentation] 次世代シークエンサーを用いた臍帯血移植片拒絶症例におけるドナー反応性T細胞クローンの追跡 (2015)
  • Author(s): 葉名尻良、村田誠、宮尾康太郎、小山大輔、酒村玲央奈、後藤辰徳、渡邊慶介、寺倉精太郎、西田徹也、清井仁
  • Organizer: 第7回血液疾患免疫療法研究会学術集会
  • Place of Presentation: 東京都文京区 東京大学伊藤国際学術研究センター
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Presentation] 抗原特異的T細胞の誘導における抗原提示細胞に発現するPD-L1の役割 (2015)
  • Author(s): 後藤辰徳、西田徹也、高木えり奈、宮尾康太郎、小山大輔、酒村玲央奈、葉名尻良、渡邊慶介、今橋伸彦、寺倉精太郎、村田誠、清井仁
  • Organizer: 第7回血液疾患免疫療法研究会学術集会
  • Place of Presentation: 東京都文京区 東京大学伊藤国際学術研究センター
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Presentation] テトラサイクリンシステムを用いたCD19CARの発現コントロール (2015)
  • Author(s): 酒村玲央奈、寺倉精太郎、渡邊慶介、宮尾康太郎、小山大輔、後藤辰徳、葉名尻良、西田徹也、村田誠、清井仁
  • Organizer: 第7回血液疾患免疫療法研究会学術集会
  • Place of Presentation: 東京都文京区 東京大学伊藤国際学術研究センター
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Patent(Industrial Property Rights)] キメラ抗原レセプター遺伝子発現システム (2015)
  • Inventor(s): 寺倉精太郎、清井仁、酒村玲央奈
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2015-099592
  • Filing Date: 2015-05-15