関節リウマチ滑膜に高発現するRasGRP4が滑膜増殖を促すメカニズムに関する研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09514
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 保田 晋助 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00374231)
• Project Period (FY): 2015-10-21 – 2018-03-31
• Keywords: 線維芽細胞様滑膜細胞 / RasGRP4 / MAPキナーゼ / TNFα / 関節リウマチ

Outline of Annual Research Achievements

関節リウマチ (RA) は慢性の関節滑膜の炎症と滑液貯留による関節痛、関節腫脹を特徴とする自己免疫性疾患である。メトトレキサートや生物学的製剤などによって関節予後は改善しているが、依然として寛解を得られない症例は5割程度存在することから新たな治療ターゲットの探索が待たれる。RasGRP4 (Ras-guanyl releasing protein 4) は主に血球系細胞に発現するRasの活性化因子であるが、我々は、RA患者の線維芽細胞様滑膜細胞 (FLS) にRasGRP4が高発現し、その増殖を促進することを明らかにした。TNFα刺激によってRasGRP4の発現が亢進することから、本研究では、RasGRP4が下流のシグナル分子を活性化する経路について検討し、滑膜増殖を制御することを目的とした。
RA滑膜におけるMAPK活性化の評価；RA滑膜におけるRasGRP4および下流のMAPKであるErkのリン酸化を組織染色によって検討した。MAPKが3種とも活性化されることも考えられ、p38 MAPKおよびJNK のリン酸化も検討した。結果、RAの滑膜組織の免疫組織化学標本においてRasGRP4、pERK、p-p38MAPKは滑膜組織表層のFLSの重層化している部分に高発現していた。HEK293細胞にRasGRP4を強制発現させることによりRaf/MEK/ERK、p38MAPK、JNKのリン酸化が検出された。継代を進めてRasGRP4の発現が低下したFLSにRasGRP4を強制発現することによってもERKおよびp38MAPKのリン酸化が検出された。
治療ターゲットとしてのRasGRP4：マウスII型コラーゲン誘導関節炎 (CIA) モデルにおいて、RasGRP4特異的siRNAを静注用試薬とともに静脈内投与することで関節炎スコアおよびmicro CT上での骨びらんを抑制することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞を用いたRasGRP4の下流シグナルメカニズムに関する検討は、比較的予想の範囲内で進捗しており、Erkのみならずp38MAPK, JNKのリン酸化も促すことが見出された。上流に関しては今後、細胞株を用いて探索するが、RasGRP4プロモーターアッセイに用いるベクターは構築済であり、比較的スムーズに検討が行えるものと想定している。ルシフェラーゼアッセイを用いるので、得られた数値の不安定性が懸念されるが、その場合は免疫沈降法など代替の手法によってTNFα刺激の下流で核内移行するNFkBとの結合を評価する。
マウス関節炎モデルの系では、siRNAを2週間隔で2回投与した。優位な関節炎スコアおよびCT所見の改善が得られたものの、投与中止後に関節炎スコアは再度悪化した。今後は、投与スケジュールの改変またはRasの活性化を直接抑制する阻害剤の使用も検討したい。

Strategy for Future Research Activity

RA滑膜におけるRasGRP4活性化機構の解明:RasGRP4 発現がRA由来FLSにおいて、TNFα刺激後に発現亢進することは示したが、そのメカニズムは明らかになっていない。RasGRP4プロモータ領域の塩基配列から、転写因子NFkBの結合部位が存在することが予測され、IkBのリン酸化、ルシフェラーゼアッセイなどを用いてTNFα刺激後のRasGRP4転写亢進機構を明らかにする。
RasGRP4欠損マウスを用いた関節炎再構成の試み: RasGRP4は主に血球系に発現するが、胎児組織や一部の悪性腫瘍にも発現することが知られている。FLSは一般に間葉系由来と理解されており、RasGRP4の発現は滑膜の腫瘍化によると理解できるが、骨髄由来細胞からFLSを誘導できるとの報告もある。関節炎に抵抗性を示すRasGRP4欠損マウスを作製、維持している米国・ハーバード大である Richard L Stevens 教授から同マウスの供与を受け、欠損マウスに自然型マウスの骨髄を移入した場合にCIAが誘導されるかどうかを検討する。関節炎が引き起こされれば、さらに単球の移入で関節炎が引き起こされるかどうかについても検討する。
リコンビナントヒトRasGRP4の作製; RasGRP4をターゲットとした新たな治療法を開発することを検討する。RA患者に対するsiRNAの全身投与は現実的には難しく、薬学研究科との共同研究や産学連携を利用したRasGRP4阻害剤の開発に向けた準備を開始する。昆虫細胞または酵母の系をもちいてリコンビナントRasGRP4蛋白を大量に作製する。リコンビナント蛋白作成後は、同センターの所有する化合物ライブラリーを用いたRasGRP4結合化合物のスクリーニングに着手する。

Causes of Carryover

経費の節約によって生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

未使用額74,775円については、今年度の物品費（実験用試薬の購入）に使用する。

Research Products

• [Journal Article] The first double-blind, randomised, parallel-group certolizumab pegol study in methotrexate-naive early rheumatoid arthritis patients with poor prognostic factors, C-OPERA, shows inhibition of radiographic progression (2016)
  • Author(s): Atsumi T, Yamamoto K, Takeuchi T, Yamanaka H, Ishiguro N, Tanaka Y, Eguchi K, Watanabe A, Origasa H, Yasuda S, Yamanishi Y, Kita Y, Matsubara T, Iwamoto M, Shoji T, Okada T, van der Heijde D, Miyasaka N, Koike T
  • Journal Title: Annals of the Rheumatic Diseases Volume: 75 Pages: 75-83
  • DOI: 10.1136/annrheumdis-2015-207511
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Assessment of risks for pulmonary infection during 12 months after commencing or intensifying immunosuppressive treatment for active connective tissue diseases: A report from a large-scale prospective cohort study (2015)
  • Author(s): Yamazaki H, Sakai R, Koike R, Miyazaki Y, Tanaka M, Nanki T, Watanabe K, Yasuda S, Kurita T, Kaneko Y, Tanaka Y, Nishioka Y, Takasaki Y, Nagasaka K, Nagasawa H, Tohma S, Dohi M, Sugihara T, Sugiyama H, Kawaguchi Y, Inase N, Ochi S, Hagiyama H, Kohsaka H, Miyasaka N, Harigai M
  • Journal Title: Journal of Rheumatology Volume: 42 Pages: 614-622
  • DOI: 10.3899/jrheum.140778
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An independent validation of the global anti-phospholipid syndrome score in Japanese cohort of patients with antoimmune diseases (2015)
  • Author(s): Oku K, Amengual O, Bohgaki T, Horita T, Yasuda S, Atsumi T
  • Journal Title: Lupus Volume: 24 Pages: 774-775
  • DOI: 10.1177/0961203314561284
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pulmonary infections following immunosuppressive treatment during hospitalization worsen the short-term vital prognosis for patients with connective tissue disease-associated interstitial pneumonia (2015)
  • Author(s): Tanaka M, Koike R, Sakai R, Saito K, Hirata S, Nagasawa H, Kameda H, Hara M, Kawaguchi Y, Tohma S, Takasaki Y, Dohi M, Nishioka Y, Yasuda S, Miyazaki Y, Kaneko Y, Nanki T, Watanabe K, Yamazaki H, Miyasaka N, Harigai M
  • Journal Title: Modern Rheumatology Volume: 25 Pages: 609-614
  • DOI: 10.3109/14397595.2014.980384
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] β2-glycoprotein I / HLA class II complexes are novel autoantigens in antiphospholipid syndrome (2015)
  • Author(s): Tanimura K, Jin H, Suenaga T, Morikami S, Arase N, Kishida K, Hirayasu K, Kohyama M, Ebina Y, Yasuda S, Horita T, Takasugi K, Ohmura K, Yamamoto K, Katayama I, Sasazuki T, Lanier LL, Atsumi T, Yamada H, Arase H
  • Journal Title: Blood Volume: 125 Pages: 2835-2844
  • DOI: 10.1182/blood-2014-08-593624
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Head-to-head comparison of the safety of tocilizumab and tumor necrosis factor inhibitors in rheumatoid arthritis patients (RA) in clinical practice: results from the registry of Japanese RA patients on biologics for long-term safety (REAL) registry (2015)
  • Author(s): Sakai R, Cho SK, Nanki T, Watanabe K, Yamazaki H, Tanaka M, Koike R, Tanaka Y, Saito K, Hirata S, Amano K, Nagasawa H, Sumida T, Hayashi T, Sugihara T, Dobashi H, Yasuda S, Sawada T, Ezawa K, Ueda A, Fujii T, Migita K, Miyasaka N, Harigai M
  • Journal Title: Arthritis Research and Therapy Volume: 17 Pages: 74
  • DOI: 10.1186/s13075-015-0583-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Surveillance for the use of mycophenolate mofetil for adult patients with lupus nephritis in Japan (2015)
  • Author(s): Yasuda S, Atsumi T, Shimamura S, Ono K, Hiromura K, Sada K, Mori M, Takei S, Kawaguchi Y, Tamura N, Takasaki Y
  • Journal Title: Modern Rheumatology Volume: 25 Pages: 854-857
  • DOI: 10.3109/14397595.2015.1031444
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A national surveillance on current use of mycophenolate mofetil for childhood-onset systemic lupus erythematosus in Japan (2015)
  • Author(s): Hara R, Miyazawa H, Nishimura K, Momoi T, Nozawa T, Kikuchi M, Sakurai N, Kizawa T, Shimamura S, Yasuda S, Hiromura K, Sada K, Kawaguchi Y, Tamura N, Takei S, Takasaki Y, Atsumi T, Mori M
  • Journal Title: Modern Rheumatology Volume: 25 Pages: 858-864
  • DOI: 10.3109/14397595.2015.1077555
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Projectile haemorrhage of a brachial artery in a patient with clinically amyopathic dermatomyositis (2015)
  • Author(s): Kono M, Yasuda S, Watanabe T, Atsumi T
  • Journal Title: Rheumatology (Oxford) Volume: 54 Pages: 1530-1531
  • DOI: 10.1093/rheumatology/kev206
  • Peer Reviewed