マイクロRNA含有エクソソームを用いた関節リウマチの新規治療の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09526
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 中町 祐司 神戸大学, 医学部附属病院, 臨床検査技師 (80379429)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 誠司 神戸大学, 医学研究科, 特命教授 (20351512) ; 三枝 淳 神戸大学, 医学部附属病院, 講師 (20514970) ; 笠木 伸平 神戸大学, 医学部附属病院, 特定助教 (80457051)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: エクソソーム / マイクロRNA / 関節リウマチ

Outline of Annual Research Achievements

関節リウマチ（RA）はわが国において70 万人以上が罹患している原因不明の自己免疫疾患である。主に中・壮年層に罹患し関節痛・関節変形によるADL・QOL の低下は、経済的損失とも相俟って医学的にも社会的にも重要な疾患である。近年の生物学的製剤による治療法は従来の治療法に比べ優れているが、無効例や効果減弱例が見られることや医療費が高価なことが問題となっている。一方、マイクロRNAはヒト遺伝子の1/3を制御していると考えられている新規の分子である。
われわれはラットアジュバンド関節炎モデルを用いてmiR-124前駆体を関節局所に投与した結果、関節炎を抑制することを明らかにした。さらに、コラーゲン誘導関節炎モデル(CIA)マウスを用いて全身投与を行ったがその効果は弱く、miR-124 を炎症局所および担当細胞に運ぶ適切な運搬体の検討が必要となった。近年、マイクロRNA を細胞外へ分泌する運搬体としてエクソソームが発見された。エクソソームは異なる種類の細胞へ取り込まれ、エクソソーム内のマイクロRNA は取り込まれた細胞で機能することが明らかになっている。
本研究は、miR-124を豊富に含むエクソソームを用いてRA の新たな治療法の開発を目的としている。
平成28年度の研究計画は関節炎治療用エクソソームを作成し、マウスCIAモデルに投与することであった。
前年度、間葉系幹細胞由来のmiR-124豊富なエクソソームがRA滑膜細胞に取り込まれ機能することを明らかにしたが、間葉系幹細胞由来のmiR-124豊富なエクソソームを動物実験に供することができるほど大量に作成することは困難であった。そこで、滑膜細胞由来細胞株E11にウイルスベクターを用いてmiR-124前駆体をトランスフェクションし、miR-124豊富なエクソソームを産生する細胞株を樹立しつつある。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

平成28年度までの実験計画はマクロファージやFLS に貪食されやすくかつ免疫能を抑制するエクソソームにmiR-124を豊富に含有させ関節炎治療用エクソソームを作成し、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル(CIA)に全身投与することであった。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞にmiR-124前駆体をトランスフェクションし、培養上清のエクソソームを超遠心法で抽出し、miR-124が豊富なヒト骨髄由来間葉系幹細胞由来エクソソームを作成したが、動物実験に供するほど大量に作成することが困難であった。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞はmiR-124の作用で分化するためmiR-124発現細胞株を樹立することができない。滑膜細胞由来細胞株E11のエクソソームがマクロファージに取り込まれることを明らかにしている。そこで、E11にウイルスベクターを用いてmiR-124前駆体をトランスフェクションしmiR-124発現細胞株を樹立しつつある。

Strategy for Future Research Activity

コラーゲン誘導関節炎(CIA)マウスにmiR-124が豊富なエクソソームを全身投与するために滑膜細胞由来細胞株にウイルスベクターを用いてmiR-124産生細胞株を樹立し、miR-124豊富なエクソソームを動物実験に供することができる量を作成する。その後、このmiR-124豊富なエクソソームを関節炎治療用エクソソームとしてマウスCIAモデルで関節炎抑制効果を検討する。関節炎マウスおよび非関節炎マウスに関節炎治療用エクソソームを尾根部に静脈投与を行い、関節炎誘導後day 45 まで関節スコア、体重を観察する。Day 45にマイクロCT で骨破壊の程度を評価した後、踵関節の病理標本を作成、HE 染色後、関節炎の程度を観察する。また副作用の影響を観察するために踵関節以外の組織も病理標本を作成し評価を行う。
また、GFP を共発現するmiR-124 発現ベクターを関節炎治療用エクソソーム産生細胞に導入し、GFP 陽性関節炎治療用エクソソームを作成する。このエクソソームをマウスCIA モデルの尾根部に静脈内投与を行い、関節炎治療用エクソソームの組織への移行をマルチスペクトルイメージング装置で確認する。
さらに、関節炎抑制の免疫的機序を明らかにするために、関節炎治療用エクソソーム投与CIAマウスの血漿中および関節組織中のサイトカイン・ケモカイン(TNFα、IL-6、IL-1β、IL-17、MCP-1など)濃度をELISAで検討する。免疫細胞の機能は脾細胞を調整し、T 細胞分画をフローサイトメトリーで評価する。また、踵関節の病理標本を作成し、免疫染色で詳細に検討する。

Causes of Carryover

当初の計画より遅れているため繰越額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

関節炎治療用エクソソームを作成し、コラーゲン誘導関節炎(CIA)マウスにこの関節炎治療用エクソソームを全身投与し関節炎抑制効果およびその機序を研究するために使用する。次年度の研究費はmiR-124が豊富なエクソソームの作成および実験関節炎モデルにおける上記エクソソームの全身投与による関節炎抑制効果の検討、組織学的および免疫学的機序の解明やその安全性の検討に使用する。設備は本大学の設備を最大現に利用し、旅費、成果発表、印刷費、通信費、翻訳・校閲、専門的知識・技術の提供、論文別刷は最低限に抑え、実験動物費、試薬等の消耗品にあてる。