2017 Fiscal Year Research-status Report
難治性真菌感染症の克服を目指した新規治療戦略の開発
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15K09573
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
宮崎 泰可 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 講師 (60448496)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗真菌薬耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は病原真菌Candida glabrataにおける多剤耐性機序の解明を目的としている。以前、研究代表者は、わずか一つの遺伝子の一つのアミノ酸変異によって多剤耐性が誘導されることを見出した。その後、DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析とリアルタイムPCRによる検証を行い、ある細胞内シグナル伝達経路の転写調節因子が活性化されることによって、薬剤排出ポンプ遺伝子の高発現をきたしていることが明らかとなった。その結果、実際に細胞内薬剤濃度が著明に減少していることをフローサイトメトリー解析で確認した。さらに、これらの関連遺伝子欠損株を作製し、感受性が回復することを確認できたため、薬剤排出ポンプの活性化が一つの機序として関与していると結論付けた。電子顕微鏡による細胞構造解析では有意な所見を認めなかったが、薬剤と標的分子の結合にも何らかの影響を及ぼしていると推察されたため細胞膜構成成分を解析し、感受性株と耐性株の間に重要な違いがあることを見出した。
また、今回の責任遺伝子の野生型と変異型にそれぞれ3xFLAG-HAタグを付け、免疫沈降法を行った。Western blottingの結果から、有意に差があるものについて、LC-MS/MSおよびMALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定した。その後、これらの遺伝子欠損株および変異株を作製して、今回の多剤耐性機序に関与している上流の細胞内シグナル伝達経路を同定した。現在、これら一連の研究成果をまとめて、学会および国際論文への発表準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度の研究計画として、C. glabrataにおける多剤耐性機序をより詳細に解明するため、関連している細胞内シグナル伝達経路の細部を検証する研究計画を掲げた。具体的には、責任遺伝子変異による二次的影響を解析後、関与していると推定された遺伝子のタグ付き株を作製し、免疫沈降法とLC-MS/MS、MALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定した。また、薬剤排出ポンプのみならず細胞膜構成成分の変化も多剤耐性に関与していると推察している。今回、C. glabrataがどのようなメカニズムで多剤耐性を獲得しているのか、関与している細胞内シグナル伝達経路を含めて明らかにすることができた。一方、新規治療薬の開発を目指した化合物ライブラリーのスクリーニングについては、効率的なアッセイ系を確立し、現在までに主要な病原真菌に活性を有するヒット化合物を複数同定できたため、それらの広域性と毒性の評価を行った。
当初予定していた研究計画は順調に進行し期待通りの成果が得られたが、本研究の目的をより精緻に達成するための追加実験を行い、これらの研究成果をまとめて次年度の学会および論文で発表するために経費の一部を平成30年度分として繰り越した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度から29年度の研究成果から、C. glabrataにおける多剤耐性機序が明らかになったため、現在学会発表と論文化の準備を進めている。
また、化合物ライブラリーのスクリーニングで得られたヒット化合物については、構造展開を行い、抗真菌活性と毒性の評価を進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた研究計画は順調に進行し期待通りの成果が得られたが、本研究の目的をより精緻に達成するための追加実験を行った。これらの研究成果をまとめ、学会および論文で発表するための経費を次年度に延長することとした。
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