2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel therapeutic strategies to overcome refractory fungal infections
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15K09573
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
宮崎 泰可 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 講師 (60448496)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗真菌薬耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は病原真菌Candida glabrataにおける多剤耐性機序の解明を目的としている。以前、研究代表者は、わずか一つの遺伝子の一つのアミノ酸変異によって多剤耐性が誘導されることを見出した。その後、DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析とリアルタイムPCRによる検証を行い、ある細胞内シグナル伝達経路の転写調節因子が活性化されることによって、薬剤排出ポンプ遺伝子の高発現をきたしていることが明らかとなった。その結果、実際に細胞内薬剤濃度が著明に減少していることをフローサイトメトリー解析で確認した。さらに、これらの関連遺伝子欠損株を作製し、感受性が回復することを確認できたため、薬剤排出ポンプの活性化が一つの機序として関与していると結論付けた。電子顕微鏡による細胞構造解析では有意な所見を認めなかったが、薬剤と標的分子の結合にも何らかの影響を及ぼしていると推察されたため細胞膜構成成分を解析し、感受性株と耐性株の間に重要な違いがあることを見出した。
また、今回の責任遺伝子の野生型と変異型にそれぞれ3xFLAG-HAタグを付け、免疫沈降法を行った。Western blottingの結果から、有意に差があるものについて、LC-MS/MSおよびMALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定後、これらの遺伝子欠損株および変異株を作製して表現型の解析を行った。その結果、今回の多剤耐性機序に関与している上流の細胞内シグナル伝達経路も明らかとなった。
最終年度には追加の検証実験を行い、これらの再現性を確認した。現在、英語論文としてまとめている。また、新規治療薬の開発を目指して化合物ライブラリーのスクリーニングを施行し、主要病原真菌に活性を有する複数のヒット化合物から構造展開および周辺化合物の探索を行った。最終的に最も優れた化合物について、広域性と毒性を評価し、こちらも現在英語論文としてまとめている。
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