2016 Fiscal Year Research-status Report

先天代謝異常症（ライソソーム病）に対する新規細胞治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	15K09603
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	石毛美夏日本大学, 医学部, 講師 (90420950)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松本太郎日本大学, 医学部, 教授 (50366580) 谷ヶ崎博日本大学, 医学部, 准教授 (90378141)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	再生医療 / 間葉系幹細胞
Outline of Annual Research Achievements	初年度は臍帯組織における間葉系幹細胞（MSC）および神経幹細胞の局在について、臍帯動脈周囲、臍帯静脈周囲、Wharton jellyの3部位において、特異的マーカーを用いて免疫組織学的検討を行い、MSCマーカー陽性細胞の多くは臍帯動脈内皮近傍およびWharton jellyに多く分布することを示した。さらに、臍帯動脈内皮直下には神経堤マーカーであるp75NTR陽性細胞が多数認められることを示し、臍帯動脈周囲組織由来の細胞は神経細胞の再生により高効率に利用できると考えられた。これらをふまえ、今年度は、p75NTR陽性細胞の機能解析を行うため、臍帯から細胞を分離し、ニューロスフェアアッセイを行った。結果、EdU取り込み能を有するスフェアが形成され、大部分の細胞はネスチンとp75NTRを発現していた。さらに、これらの細胞は神経細胞やグリア細胞への分化能を有していた。以上より、臍帯動脈から単離した細胞の中にニューロスフェア形成能を有する神経幹細胞が存在し、これらは神経細胞やグリア細胞に分化し、ライソソーム病の神経障害に対する細胞治療に応用可能であることが示された。さらに、臍帯、胎盤羊膜上皮および羊膜間質由来のMSCの免疫抑制に関する機能解析を末梢血リンパ球増殖反応に対する共培養系を用いて行った。抗CD3/CD28抗体とrIL-2によりリンパ球を刺激し増殖させ、臍帯、胎盤羊膜上皮および羊膜間質由来MSCと共培養を行いリンパ球増殖に与える抑制効果をCFSE（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）アッセイを用いて検討した。結果、すべてのMSCでリンパ球の増殖は抑制されたが、臍帯由来MSCが最も抑制効果が高いことが示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 臍帯各部位における神経幹細胞の単離を行うべくp75NTR陽性細胞のみでのニューロスフェアアッセイを行いたかったが、p75NTR細胞のみでは十分な細胞数が得られず培養や機能解析に結びつかなかった。そのため、検討方法を変更し臍帯全体の細胞で行うこととした。 MSCの免疫抑制に関する機能解析では、3種類のMSCの比較が可能なリンパ球刺激条件や細胞密度比、間接的もしくは直接的共培養などの検討に時間を有し、進行が遅れることとなった。
Strategy for Future Research Activity	臍帯p75NTR陽性細胞解析においては、陽性細胞のみの単離では培養が困難であると判断し、p75NTR陽性細胞を含む臍帯動脈周囲組織全体を単離して機能解析および細胞治療への応用方法を検討することとした。また、臍帯および羊膜由来MSC細胞の機能解析においては、リンパ球刺激の培養条件の検討に時間がかかることとなったが、適切な条件がみつかっており、今後は現在の条件で例数を増やして検討をしていく予定である。
Causes of Carryover	培養方法の条件や染色の条件について慎重に検討を行い、進行が予想より遅れることとなってしまった。そのため、細胞の機能解析が十分に行えず、その実験のために計上していた消耗品や動物の使用が少なくなった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	培養方法および使用組織・細胞について検討し、分離培養にかかる時間を減らし、培養効率をあげて。細胞のin vitro、in vivo機能解析を行う。臍帯、羊膜、骨髄からMSCを含む細胞を効率をあげて分離培養し、定常状態または今回検討したサイトカイン刺激下における各種因子の発現の変化をPCR法などを用いて調べ、免疫寛容誘導機能を検討する。臍帯からはp75NTR由来神経幹細胞を含む分画の細胞機能を検討する。これら細胞の造血幹細胞機能の維持、増殖、ホーミングに与える影響および神経細胞保護・再生機能について、各種因子の発現の変化や共培養により検討したうえで、これらの培養細胞のうち適切なものを用いて、生着不全モデルや疾患モデルを用いたin vivoでの細胞治療の条件設定を行う。