2016 Fiscal Year Research-status Report
有害免疫反応を示さない高機能酵素の開発とそのファブリー病治療への応用
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15K09606
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
櫻庭 均 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (60114493)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝学 / 改変酵素 / バイオテクノロジー / ファブリー病 / 酵素補充療法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
α-ガラクトシダーゼA (GLA)欠損症であるファブリー病に対して、有害免疫反応を惹起しない酵素補充治療薬の創出を目的として、研究を行った。
昨年度（研究初年度）に生産方法を確立した、GLA活性を持つ改変型ヒトα -N-アセチルガラクトサミニダーゼ（NAGA）の治療効果を調べるため、細胞および動物実験を行った。GLAノックアウトマウス胎児由来iPS細胞から分化誘導した培養心筋細胞および培養線維芽細胞を試料として、培養液中に改変型NAGAを添加した所、細胞内GLA活性が容量依存的に増加した。また、マンノース 6-リン酸（M6P）の同時添加により、細胞内GLA活性増加が抑制されたことから、改変型NAGA は主にM6P受容体を介して細胞内に取り込まれたと考えられた。
今年度は、生後5週齢のヒトNAGAトランスジェニック・GLAノックアウトマウスに対して、改変型NAGAを尾静脈内に複数回投与した所、肝、腎および心組織内のグロボトリアオシルセラミドやグロボトリアオシルスフィンゴシンなどの糖脂質の蓄積量が減少し、病理学的に、層状封入体の形成が抑制された。GLAノックアウトマウスに対してヒトGLAを繰り返し投与した場合、ヒトGLAに対するIgG1およびIgG2a抗体がマウス血中に産生され、ヒスタミン含量が増加して死亡するのに対して、ヒトNAGAトランスジェニック・GLAノックアウトマウスに対して改変型NAGAを繰り返し投与しても、同酵素に対する血中IgG1およびIgG2a抗体の産生やヒスタミン含量の増加は認められず、マウスの死亡例はなく行動にも異常はみられなかった。
改変型NAGAは、ファブリー病の新規治療薬として有望であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究初年度（平成27年度）には、無血清培養液を用いた浮遊CHO細胞で改変型NAGAを生産する方法を確立し、同酵素をカラムクロマトグラフィーで精製した。そして、精製された改変型NAGAが、GLA酵素活性を獲得したことを示した。また、改変型NAGA投与により誘発される免疫反応を調べるため、体内酵素に関してファブリー病患者と同様の状態（GLA欠損、且つ、NAGA保持）にあるヒトNAGAトランスジェニック・GLAノックアウトマウスを作製した。
今年度（平成28年度）は、これらの試料と動物を用いて、改変型NAGAのファブリー病治療薬としての有効性と副作用に関して調べた。その結果、改変型NAGAは、M6P受容体を介して、細胞内に取り込まれ、疾患モデルマウスの臓器における糖脂質蓄積を抑制することが示された。また、現行のGLAを用いた酵素補充治療時に問題となる有害免疫反応はみられなかった。
以上の如く、研究はほぼ予定通りに進行しており、当初の計画どおり、GLAと改変型NAGAの免疫反応に関する解析を次年度に進めることが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究最終年度（平成29年度）には、ファブリー病に対する酵素補充治療中に起こり得る免疫反応に関して、詳細な情報を得るため、GLAおよび改変型NAGAと夫々の酵素に対する抗体（抗血清）を試料として、ELISA、表面プラズモン共鳴やウェスタンプロッティングなどの方法により、抗原－抗体反応を詳細に解析する。
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| Causes of Carryover |
次年度は、当該研究の最終年度であり、有害免疫反応を誘発しない新規酵素によるファブリー病治療薬開発が可能な否かに関して結論を得るため、候補となる酵素タンパクと各種抗体との反応を解析する必要がある。そのための試薬購入費が必要である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
GLAおよび改変型NAGAと夫々の酵素に対する抗体（抗血清）を試料として、ELISA、表面プラズモン共鳴やウェスタンプロッティングなどの方法により、抗原－抗体反応を詳細に解析する。
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