2016 Fiscal Year Research-status Report
CDKL5遺伝子変異によるてんかん性脳症のシナプス分子病態機序と治療法の解明
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15K09614
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
田中 輝幸 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (10246647)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | てんかん / 発達障害 / レット症候群 / シナプス / NMDA受容体 / ノックアウトマウス / キナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【結果】H28年度は、前年度に引き続き、CDKL5 欠失によるシナプス機能異常の分子機構の解明研究を推進した。Cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5)ノックアウト(KO)マウスは、興奮性シナプス後肥厚部 (PSD)においてNMDA型グルタミン酸受容体サブユニット蛋白GluN2Bの異常集積を来す事から、CDKL5はPSD局在蛋白をリン酸化し、NMDA型受容体サブユニット蛋白の動態を制御するという仮説を立て、その検証を行った。方法として、NMDA受容体サブユニット蛋白とその相互作用蛋白、及び酵母ツーハイブリッドスクリーニングで同定したCDKL5相互作用蛋白候補、計9種類の蛋白について、大腸菌、HEK293T細胞、及び小麦胚芽抽出系を用いて組み換え蛋白を発現・精製し、in vitro キナーゼアッセイ、Pho-tag PAGE解析などによって、リン酸化の同定を行った。その結果、NMDA受容体サブユニット蛋白の足場蛋白SAP102に結合し、細胞内輸送に重要な役割を果たす蛋白の一つが、CDKL5による間接的なリン酸化制御を受けること、更に微小管モーター蛋白の一つが、CDKL5による直接的リン酸化を受けることを同定した。
【意義・重要性】本年度の極めて重要な成果は、NMDA受容体サブユニット蛋白の足場蛋白SAP102の動態制御に関わる蛋白がCDKL5によるリン酸化制御を受けることと、微小管モーター蛋白の一つがCDKL5による直接リン酸化を受けることを明らかにした事である。これらのリン酸化制御は、細胞内蛋白動態を制御することが示唆される。CDKL5遺伝子変異に伴う病態は、CDKL5リン酸化の欠失によるシナプス受容体蛋白動態制御異常によるシナプス機能不全である事が強く示唆され、神経発達障害の分子基盤、病態機序解明のための大きな進歩と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度までの研究で、CDKL5による、NMDA型グルタミン酸受容体蛋白の動態制御蛋白2種類のリン酸化を同定できた。これは極めて重要な新規の発見であり、CDKL5 loss-of-function (LOF) 分子機構の解明、さらにヒトの病態解明、治療法解明のための理論的根拠となる重要なデータである。当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究の成果を更に追求し、CDKL5による興奮性シナプス後肥厚部蛋白のリン酸化の有無による蛋白動態の差異を定量的に同定する。リン酸化のアミノ酸部位を同定し、リン酸化による機能調節のより正確な分子機構を同定する。更にin vivoにおいてCDKL5リン酸化の喪失によりシナプス機能不全が生じる分子機構を解明する。同時に、Cdkl5 KOマウスの海馬、扁桃体、大脳皮質の微細構造・機能解析を進め、異常表現型の責任病巣をより正確に同定
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| Causes of Carryover |
H28年度末に計画していた実験予定が変更となり、試薬購入の時期を次年度に移したことから、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬購入をH29年度に行い、実験を行う。
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Research Products
(2 results)
