2015 Fiscal Year Research-status Report

骨細胞におけるリンの感知と低リンくる病責任分子の発現制御：Pit1の関与について

Research Project

Project/Area Number	15K09635
Research Institution	Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health
Principal Investigator	山崎美和 (若林美和) 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センター(研究所), その他部局等, 研究員 (50455549)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	リン / Pit-1
Outline of Annual Research Achievements	骨芽細胞・骨細胞には複数の遺伝性低リン血症性くる病責任分子が発現しており、リン代謝において重要な役割をはたすが、骨芽細胞・骨細胞が体内のリンの過不足を感知する機構については不明である。本研究においては、ゲノム編集のCRISPR/Casシステムを利用し、リンを細胞内へと輸送するⅢ型ナトリウム-リン酸共輸送担体であるPit-1をノックアウトした細胞（Pit-1 KO細胞）を作成し、リン惹起シグナル受容におけるPit-1の役割について解析している。Invitrogen社のGeneArt CRISPR Nuclease vectorを使用し、標的DNA部位に一致する20bpのguide sequencesをクローニングした。マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞に導入後、クローンを単離した。各クローンのPit-1遺伝子配列をシーケンサーにて確認し、欠損、変異が生じフレームシフトが生じてPit-1遺伝子がノックアウトされているクローンを選択した。また遺伝子修復によりPit-1遺伝子に変異が生じていないコントロール細胞も同時に選択した。32Pを用いたリン酸輸送アッセイにより、Pit-1 KO細胞においてはリン酸の取り込みが減弱していることを確認した。7 mMリン酸刺激によりコントロール細胞ではdentin matrix protein 1 (Dmp1)の発現が強く誘導されたが、Pit-1 KO細胞においてはこの発現誘導が減弱していた。またリン酸とアスコルビン酸により8週間分化誘導したところ、コントロール細胞ではリン酸により発現が誘導されるOsteopontinの発現が有意に上昇したが、Pit-1 KOでは明確な差は見られなかった。これらのことから、Pit-1遺伝子の欠損が、骨芽細胞の細胞外無機リン酸応答性に影響を及ぼすことが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Pit-1 KO細胞の樹立が終了し、その解析を進めることができている。MC3T3-E1細胞親株を使用したリン酸応答性の検討が順調に進んでいるため、Pit-1 KO細胞を使用したリン酸刺激により惹起されるシグナル受容やリン代謝関連遺伝子の発現の比較検討を順調に進めることができている。
Strategy for Future Research Activity	リン酸輸送能を欠くPit-1変異体を用いて、リン酸惹起シグナルにおけるPit-1の機能がリン酸の細胞内取り込みに依存した機能であるのか否かを検討する。リン酸輸送能を欠く変異体Pit-1 S132Aをレンチウイルスベクターにクローニングし、樹立したPit-1 KO細胞へ導入する。Pit-1の発現を確認後、この変異体がリン酸輸送能を欠くことを上述のリン酸輸送アッセイにより確認する。リン酸応答性をDmp1の発現を指標に検討し、また様々な濃度のリン酸存在下でリン代謝関連遺伝子の発現を解析する。またCRISPR/Casシステムを使用し、同じくⅢ型ナトリウム-リン酸共輸送担体であるPit-2をノックアウトした細胞を樹立し、リン代謝制御におけるPit-1とPit-2の機能の違いを明確にする。