2015 Fiscal Year Research-status Report
高IgM症候群の原因遺伝子同定によるヒト免疫グロブリンクラススイッチ機構の解明
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15K09640
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
今井 耕輔 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (90332626)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 原発性免疫不全症 / 免疫グロブリン / クラススイッチ / ＤＮＡ損傷修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今回の研究では、研究代表者らが2003年に提唱した原発性免疫不全症であるＢ細胞特異的高IgM症候群(HIGM)であるHIGM4型の病態解明および原因遺伝子の同定とその機能解析により、ヒト免疫グロブリンクラススイッチ再構成機構を解明することを目的とする。原因遺伝子の同定には既に施行した国内HIGM症例の次世代シークエンサー（NGS）による全エクソン解析の結果を用いる。平成27年度は、既知遺伝子を同定した抗体産生不全患者について10本の論文を報告し、新たに8患者8遺伝子異常を同定した。Ｔ細胞新生能を示すTRECの低下例ではV(D)J再構成異常を伴い放射線高感受性であることを想定していたが、活性化PI3K症候群患者8例（PIK3CD: 4例、PIK3R1: 2例、PTEN: 2例) が含まれていた。これらの患者では、NGSによるB・Ｔ細胞受容体のレパトア解析、IgV領域体細胞突然変異解析においても異常を認めなかった。そのため、APDS患者では、免疫細胞の老化亢進によるTREC低下であると考えられた。APDS1については、全国で21例を同定し、IgG2の低下は90％に見られた。IgA, IgG3,G4については、半数の症例で低下していた。ｋ患者では、sCD40L+IL10,IL21刺激時のAID転写の低下、IgG2, G4の胚細胞型転写(GLT)、機能型転写(FT)の誘導低下が見られた。平成28年度は、Taqman法あるいはddPCRを用いて、こうした転写産物について検討し、APDSにおけるクラススイッチ異常の機構について検討したい。当初計画にあるNGSを用いたIgS-SHMの検討、IgS-DSBのTaqman法あるいはddPCR法による検討、Sμ/Sεの3D-FISHによる検討についても行う。また、WES解析結果から、新たな原因遺伝子の同定を目指したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) 全エクソンシークエンスによるHIGM4原因遺伝子の同定：申請段階で同定していた12遺伝子の異常症については、10本の論文にまとめて報告しており、さらに投稿後修正中、投稿準備中である。新たに、8患者について、8遺伝子の異常を同定し (CTLA4, FOXP3, IKZF1, NFKB1, NFKB2, TACI, TRNT1, XIAP異常)、一部については投稿準備中である。それ以外の未同定の患者については、家系分析を加え、SNPchipを用いた連鎖解析も加えて、同定を試みている。
２）HIGM4の病態解析
a) TREC定量、KREC定量とV(D)J再構成についての検討：Ｔ細胞の新生能を反映するTREC陰性患者の中に4例、機能獲得型PIK3CD異常症(APDS)患者を同定した。これらの患者では、FACS解析においてもCD31+45RA+CD4+ナイーブＴ細胞の減少、CD27+メモリーＢ細胞の減少とCD10+19+20+24++38++移行Ｂ細胞の上昇を認めた。また、PIK3R1異常症患者、PTEN異常症患者についても同様の所見を認めたが、Ｂ細胞については、IgD-CD27+メモリーＢ細胞が存在する例もあり、PIK3CD異常症とは若干異なる可能性が考えられた。また、TRECs低値を示したAPDS患者2例で、V(D)J領域の配列解析、IgV-SHMの変異塩基解析をNGSにより行ったが、健常者との大きな違いは認めなかった。
b)定量PCRによるgermline, functional, circle transcriptの評価法の検討：in vitro CSRを検討する際、特に、APDSのようなシグナル伝達異常の際、どこが阻害され、クラススイッチが阻害されているかをみるためにも、germline, functional, circle transcriptについて、刺激サイトカイン毎、各Igクラス毎に検討が必要である。APDS1患者では、sCD40L+IL10, IL21刺激時のAID転写の低下、IgG2, G4の胚細胞型転写(GLT)、機能型転写(FT)の誘導低下が見られた。ただ、IgG1/2、IgA1/2の環状転写(CT)は、配列の相同性が高いため、定量ＰＣＲでの検討では、分別することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
a) WESによるHIGM4患者の原因遺伝子の同定を引き続き行う。
b) Taqman法あるいはddPCRを用いて、GLT/CT/FTなどの転写産物について検討し、APDSにおけるクラススイッチ異常の機構について検討する。APDS-1/-2/-L患者Ｂ細胞では、sCD40L+サイトカイン刺激後の増殖能、NFkBリン酸化については、正常であり、AKT, S6のリン酸化は亢進していることは見出しているが、その更に下流の転写因子などについては検討中であり、今年度、来年度で検討したい。
c) Ig遺伝子スイッチ(S)領域体細胞突然変異(IgS-SHM)の検討：本研究ではHIGM４患者細胞を用い、IgSμ-SHMの解析をNGSを用いて行い、障害されているDNA修復機構を検討する。
b) S領域のDNA二重鎖切断(DSB)の検討：クラススイッチが起こる際、AIDによる変異誘導とUNG、MMRによる認識・切断により、S領域に生じるDNA二重鎖切断(DSB) をTaqman法を用いたreal-time PCRを用いてHIGM4患者において定量する。これにより、障害がDSBの前(DNA鎖切断異常)か後(DNA鎖修復異常)かが明らかになる。
c) クラススイッチ刺激時のSμ/Sε(IgE遺伝子S領域)の3D-FISH法による測定：SμとSεは200kb以上離れているが、クラススイッチの際には53BP1とリン酸化ヒストンH2AX依存性に接近する(synapsing)ことが知られている。蛍光顕微鏡を用いた3D-FISH法により、HIGM4患者Ｂ細胞を用い、クラススイッチ刺激後の2点間距離の測定、53BP1のfocus形成がみられるかについて検討し、synapsing分子異常の有無を明らかにする。
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[Journal Article] Novel compound heterozygous DNA ligase IV mutations in an adolescent with a slowly-progressing radiosensitive-severe combined immunodeficiency2015
Author(s)
Tamura S, Higuchi K, Tamaki M, Inoue C, Awazawa R, Mitsuki N, Nakazawa Y, Mishima H, Takahashi K, Kondo O, Imai K, Morio T, Ohara O,et al
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Journal Title
Clin Immunol
Volume: 160
Pages: 255-260
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Multicenter experience in hematopoietic stem cell transplantation for serious complications of common variable immunodeficiency.2015
Author(s)
Wehr C, Gennery A, Lindemans C, Schulz A, Hoenig M, Marks R, Recher M, Gruhn B, Holbro A, Heijnen I, Meyer D, Grigoleit G, Einsele H, Baumann U, Witte T, Sykora KW, Goldacker S, Regairaz L, Aksoylar S, Ardeniz Ö, Zecca M, Zdziarski P, Meyts I, Matthes-Martin S, Imai K, et al
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Journal Title
J Allergy Clin Immunol.
Volume: 135
Pages: 988-97.e6
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] RAG1 deficiency may present clinically as selective IgA deficiency.2015
Author(s)
Kato T, Crestani E, Kamae C, Honma K, Yokosuka T, Ikegawa T, Nishida N, Kanegane H, Wada T, Yachie A, Ohara O, Morio T, Notarangelo LD, Imai K, Nonoyama S
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Journal Title
J Clin Immunol.
Volume: 35
Pages: 280-288
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Mutations in Bruton's tyrosine kinase impair IgA responses2015
Author(s)
Mitsuiki N, Yang X, Bartol SJ, Grosserichter-Wagener C, Kosaka Y, Takada H, Imai K, Kanegane H, Mizutani S, van der Burg M, van Zelm MC, Ohara O, Morio T
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Journal Title
Int J Hematol.
Volume: 101
Pages: 305-313
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Dysgammaglobulinemia Associated With Glu349del, a Hypomorphic XIAP Mutation.2015
Author(s)
Nishida N, Yang X, Takasaki I, Imai K, Kato K, Inoue Y, Imamura T, Miyashita R, Kato F, Yamaide A, Mori M, Saito S, Hara J, Adachi Y, Miyawaki T,Kanegane H
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Journal Title
J Investig Allergol Clin Immunol
Volume: 25
Pages: 205-213
Peer Reviewed
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