高IgM症候群の原因遺伝子同定によるヒト免疫グロブリンクラススイッチ機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09640
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 今井 耕輔 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (90332626)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 原発性免疫不全症 / 免疫グロブリン / クラススイッチ / DNA損傷修復

Outline of Annual Research Achievements

今回の研究では、研究代表者らが2003年に提唱した原発性免疫不全症であるＢ細胞特異的高IgM症候群(HIGM)であるHIGM4型の病態解明および原因遺伝子の同定とその機能解析により、ヒト免疫グロブリンクラススイッチ再構成機構を解明することを目的としている。原因遺伝子の同定には既に施行した国内HIGM症例の次世代シークエンサー（NGS）による全エクソン解析の結果を用いた。昨年度までに、Ｔ細胞新生能を示すTRECの低下例の中から、活性化PI3K症候群患者8例（PIK3CD: 4例、PIK3R1: 2例、PTEN: 2例) を同定していたため、機能解析を行い、NGSによるB・Ｔ細胞受容体のレパトア解析、IgV領域体細胞突然変異解析においても異常を認めなかった。そのため、APDS患者では、免疫細胞の老化亢進によるTREC低下であると考えられた。APDS1については、全国で22例を同定し、IgG2の低下は90％に見られた。IgA, IgG3,G4については、半数の症例で低下していた。患者では、sCD40L+IL10,IL21刺激時にNFKBのリン酸化は障害されていなかったが、AID転写の低下、IgG2, G4の胚細胞型転写(GLT)、機能型転写(FT)の誘導低下が見られた。成果発表を第1回アジア太平洋免疫不全症学会にて行い(Yeh, et al.; Okano, et al.; Imai)、3本の論文発表を行った（Coulter et al. JACI; Elkaim et al. JACI; Tsujita et al. JACI）。
さらに、今年度、新たに、ノックアウトマウスでIgAクラススイッチが障害されるとされている遺伝子に変異を持つ1症例を世界で始めて同定した。本患者における、抗体産生不全の機構について、詳細に検討しすることを平成29年度の目標としたい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1) 全エクソンシークエンスによるHIGM4原因遺伝子の同定：申請段階で同定していた12遺伝子の異常症については、10本の論文にまとめて報告しており、さらに投稿後修正中、投稿準備中である。新たに、8患者について、8遺伝子の異常を同定し (CTLA4, FOXP3, IKZF1, NFKB1, NFKB2, TACI, TRNT1, XIAP異常)、一部については投稿準備中である。それ以外の未同定の患者については、家系分析を加え、SNPchipを用いた連鎖解析も加えて、同定を試みた。今年度新たに抗体産生不全症の中からDNMT3B変異のICF症候群の成人姉妹例2例や、CD40L欠損症でニューモシスチス肺炎で亡くなった乳児、日本で2例目のICOS欠損症に加え、NFKBを制御するIkB kinase複合体をユビキチン化するユビキチンリガーゼHOIL1の異常症を日本で始めて同定した。さらに、複数の新規遺伝子を同定しており、その蛋白発現、機能異常についても検討中である。
２）HIGM4の病態解析
定量PCRによるgermline, functional, circle transcriptの評価法の検討：in vitro CSRを検討する際、特に、APDSのようなシグナル伝達異常の際、どこが阻害され、クラススイッチが阻害されているかをみるためにも、germline, functional, circle transcriptについて、刺激サイトカイン毎、各Igクラス毎に検討が必要である。APDS1患者では、sCD40L+IL10, IL21刺激時のAID転写の低下、IgG2, G4の胚細胞型転写(GLT)、機能型転写(FT)の誘導低下が見られた。ただ、IgG1/2、IgA1/2の環状転写(CT)は、配列の相同性が高いため、定量ＰＣＲでの検討では、分別することができなかった。

Strategy for Future Research Activity

a) WESにより同定したIgA欠損を伴う1患者について、その遺伝子変異によるクラススイッチへの影響について、検討する。
b) Taqman法あるいはddPCRを用いて、GLT/CT/FTなどの転写産物について検討し、APDSにおけるクラススイッチ異常の機構について検討する。APDS-1/-2/-L患者Ｂ細胞では、sCD40L+サイトカイン刺激後の転写因子発現などについて、今年度検討したい。
c) Ig遺伝子スイッチ(S)領域体細胞突然変異(IgS-SHM)の検討：本研究ではHIGM４患者細胞を用い、IgSμ-SHMの解析をNGSを用いて行い、障害されているDNA修復機構を検討する。
b) S領域のDNA二重鎖切断(DSB)の検討：クラススイッチが起こる際、AIDによる変異誘導とUNG、MMRによる認識・切断により、S領域に生じるDNA二重鎖切断(DSB) をTaqman法を用いたreal-time PCRを用いてHIGM4患者において定量する。これにより、障害がDSBの前(DNA鎖切断異常)か後(DNA鎖修復異常)かが明らかになる。
c) クラススイッチ刺激時のSμ/Sε(IgE遺伝子S領域)の3D-FISH法による測定：SμとSεは200kb以上離れているが、クラススイッチの際には53BP1とリン酸化ヒストンH2AX依存性に接近する(synapsing)ことが知られている。蛍光顕微鏡を用いた3D-FISH法により、HIGM4患者Ｂ細胞を用い、クラススイッチ刺激後の2点間距離の測定、53BP1のfocus形成がみられるかについて検討し、synapsing分子異常の有無を明らかにする。
以上の方法を用いて、HIGM4患者B細胞の病態解析を行い、本疾患のIgCSR、IgV-SHM、IgS-SHM機構の異常の原因を明らかにする。

Causes of Carryover

当初の予定より使用金額が少額だったため、残金は次年度の研究費に持ち越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

最終年度の研究費として試薬等購入経費として使用する。

Research Products

• [Journal Article] Clinical spectrum and features of activated phosphoinositide 3-kinase δ syndrome: A large patient cohort study (2017)
  • Author(s): Coulter TI, Chandra A, Bacon CM, Imai K,
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: 139 Pages: 597-606
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.06.021.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Hematopoietic Stem Cell Transplantation for XIAP Deficiency in Japan. (2017)
  • Author(s): Ono S, Okano T, Hoshino A, Yanagimachi M, Hamamoto K, Nakazawa Y, Imamura T, Onuma M, Niizuma H, Sasahara Y, Tsujimoto H, Wada T, Kunisaki R, Takagi M, Imai K, Morio T, Kanegane H
  • Journal Title: J. Clin. Immunol Volume: 37 Pages: 85-91
  • DOI: 10.1007/s10875-016-0348-4.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reticular dysgenesis: international survey on clinical presentation, transplantation and outcome (2017)
  • Author(s): Hoenig M, Lagresle-Peyrou C, Pannicke U, Notarangelo LD, Porta F, Gennery AR, Slatter M, Cowan MJ, Stepensky P, Al-Mousa H, Al-Zahrani D, Pai SY, Al Herz W, Gaspar HB, Veys P, Oshima K, Imai K, Yabe H, Noroski LM, Wulffraat NM, Sykora KW,
  • Journal Title: Blood. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1182/blood-2016-11-745638.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A Stable Mixed Chimera After SCT with RIC in an Infant with IκBα Hypermorphic Mutation. (2017)
  • Author(s): Nagasawa M,Ohkawa T,Takagi M, Imai K, Morio T.
  • Journal Title: J Clin Immunol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s10875-017-0375-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HLA haploidentical hematopoietic cell transplantation using clofarabine and busulfan for refractory pediatric hematological malignancy. (2017)
  • Author(s): Takagi M, Ishiwata Y, Aoki Y, Miyamoto S, Hoshino A, Matsumoto K, Nishimura A, Tanaka M, Yanagimachi M, Mitsuiki N, Imai K, Kanegane H, Kajiwara M, Takikawa K, Mae T, Tomita O, Fujimura J, Yasuhara M, Tomizawa D, Mizutani S, Morio T.
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 105 Pages: 686-691
  • DOI: 10.1007/s12185-017-2187-3.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Placental Transfer of Canakinumab in a Patient with Muckle-Wells Syndrome. (2017)
  • Author(s): Egawa M, Imai K, Mori M, Miyasaka N, Kubota T.
  • Journal Title: J Clin Immunol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s10875-017-0389-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Abnormal hematopoiesis and autoimmunity in human subjects with germline IKZF1 mutations. (2017)
  • Author(s): Hoshino A, Okada S, Yoshida K, Nishida N, Okuno Y, Ueno H, Yamashita M, Okano T, Tsumura M, Nishimura S, Sakata S, Kobayashi M, Nakamura H, Kamizono J, Mitsui-Sekinaka K, Ichimura T, Ohga S, Nakazawa Y, Takagi M, Imai K, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Ogawa S, Kojima S, Nonoyama S, Morio T, Kanegane H.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: 140 Pages: 223-231
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.09.029.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prolonged neutropenia due to antihuman neutrophil antigen 2 (CD177) antibody after bone marrow transplantation. (2017)
  • Author(s): Wada T, Miyamoto S, Okamoto H, Matsuda Y, Toma T, Imai K, Takagi M, Morio T, Yachie A.
  • Journal Title: Pediatr Blood Cancer. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1002/pbc.26388
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Haploinsufficiency of TNFAIP3 (A20) by germline mutation is involved in autoimmune lymphoproliferative syndrome. (2017)
  • Author(s): Takagi M, Ogata S, Ueno H, Yoshida K, Yeh T, Hoshino A, Piao J, Yamashita M, Nanya M, Okano T, Kajiwara M, Kanegane H, Muramatsu H, Okuno Y, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Bando Y, Kato M, Hayashi Y, Miyano S, Imai K, Ogawa S, Kojima S, Morio T.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: 139 Pages: 1914-1922
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.09.038.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphatase and tensin homolog (PTEN) mutation can cause activated phosphatidylinositol 3-kinase δ syndrome-like immunodeficiency. (2016)
  • Author(s): Tsujita Y, Mitsui-Sekinaka K, Imai K, Yeh TW, Mitsuiki N, Asano T, Ohnishi H, Kato Z, Sekinaka Y, Zaha K, Kato T,
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: 138 Pages: 1672-1680
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.03.055.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Successful T-cell reconstitution after unrelated cord blood transplantation in a patient with complete DiGeorge syndrome (2016)
  • Author(s): Kojima D, Muramatsu H, Okuno Y, Kataoka S, Murakami N, Tanahashi Y, Suzuki K, Kato T, Sekiya Y, Kawashima N, Narita A, Nishio N, Hama A, Imai K, Nonoyama S, Takahashi Y, Kojima S.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: 138 Pages: 1471-1473
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.04.048.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X-linked agammaglobulinemia: Twenty years of single-center experience from North West India. (2016)
  • Author(s): Singh S, Rawat A, Suri D, Gupta A, Garg R, Saikia B, Minz RW, Sehgal S, Chan KW, Lau YL, Kamae C, Honma K, Nakagawa N, Imai K, Nonoyama S, Oshima K, Mitsuiki N, Ohara O.
  • Journal Title: Ann Allergy Asthma Immunol. Volume: 117 Pages: 405-411
  • DOI: 10.1016/j.anai.2016.07.044.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Novel compound heterozygous mutations in a Japanese girl with Janus kinase 3 deficiency (2016)
  • Author(s): Sato T, Okano T, Tanaka-Kubota M, Kimura S, Miyamoto S, Ono S, Yamashita M, Mitsuiki N, Takagi M, Imai K, Kajiwara M, Ebato T, Ogata S, Oda H, Ohara O, Kanegane H, Morio T.
  • Journal Title: Pediatr Int. Volume: 58 Pages: 1076-1080
  • DOI: 10.1111/ped.13070.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical and immunologic phenotype associated with activated phosphoinositide 3-kinase δ syndrome 2: A cohort study. (2016)
  • Author(s): Elkaim E, Neven B, Bruneau J, Mitsui-Sekinaka K, Imai K, et al.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: 138 Pages: 210-218
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2016.03.022.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] X連鎖性高IgM症候群に対する強度減弱前処理による造血細胞移植. (2017)
  • Author(s): 西村聡, 星野顕宏, 松本和明, 小野真太郎, 田中真理, 足洗美穂, 満生紀子, 宮村能子, 橋井佳子, 磯田健志, 柳町昌克, 梶原道子, 高木正稔, 今井耕輔, 金兼弘和, 森尾友宏.
  • Organizer: 第39回日本造血細胞移植学会総会
  • Place of Presentation: くにびきメッセ・島根県民会館（島根県・松江市）・
  • Year and Date: 2017-03-03
• [Presentation] 39歳時に初めて診断に至ったCD40Ｌ欠損症の一例 (2016)
  • Author(s): 松田裕介,小泉瑛子,村岡正裕,白橋徹志郎,栂暁子,岡本浩之,和田泰三,東馬智子,谷内江昭宏,田中桂輔,今井耕輔,金兼弘和,森尾友宏,
  • Organizer: 第48回日本小児感染症学会学術集会
  • Place of Presentation: 岡山コンベンションセンター(岡山県・岡山市）
  • Year and Date: 2016-11-19
• [Presentation] Primary antibody deficiency in Japan:overview and P13K related disorders. (2016)
  • Author(s): Imai K
  • Organizer: XLP-WAS 2016 Symposium-London
  • Place of Presentation: イギリス（ロンドン）
  • Year and Date: 2016-09-27
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] IkB-αS32 Mutations Underly Ectodermal Dysplasia with Immunodeficiency Manifestations and Correlation with Immunological Parameters. (2016)
  • Author(s): Moriya K, Tanita K, Ohnishi H, Niizuma H, Rikiishi T, Nishikomori R, Ishige T, Imai K, Kanegane H, Sasahara Y, Arakawa H, Kure S, Morio T.
  • Organizer: 17th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies
  • Place of Presentation: スペイン（バルセロナ）
  • Year and Date: 2016-09-21 – 2016-09-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Activated P13 Kinase Delta Syndrome (APDS)-Like Immunodeficiency Caused by PTEN Mutation (2016)
  • Author(s): Mitsui-Sekinaka K, Imai K, Tsujita Y, Mitsuiki N, Asano T, Sekinaka Y, Kanegane H, Yoshida K, Miyano S, Kojima S, Ogawa S, Ohara O, Okada S, Kobayashi M, Takagi M, Morio T, Nonoyama S.
  • Organizer: 17th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies
  • Place of Presentation: スペイン（バルセロナ）
  • Year and Date: 2016-09-21 – 2016-09-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 低または無ガンマグロブリン血症50例に対する皮下注用人免疫グロブリン製剤導入 (2016)
  • Author(s): 足洗美穂,金兼弘和,今井耕輔,木村菜美子,陳菜穂,岡野翼,小野真太郎,田中真理,宮本智史,小林千佳,満生紀子,青木由貴,田中絵里子,高木正稔,森尾友宏.
  • Organizer: 第7回関東甲越免疫不全症研究会
  • Place of Presentation: ステーションコンファレンス東京（東京都・千代田区）
  • Year and Date: 2016-09-18
• [Presentation] IKBA遺伝子異常による免疫不全症を伴う無汗性外胚葉形成不全症(EDA-ID)に合併した腸炎の一例 (2016)
  • Author(s): 五十嵐淑子, 石毛崇, 西田豊, 鎌田亜希子, 八木久子, 滝沢琢己, 荒川浩一, 河合朋樹, 今井耕輔, 河合利尚
  • Organizer: 第43回日本小児栄養消化器肝臓学会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • Year and Date: 2016-09-17
• [Presentation] Activated PI3Kδ syndromeにおけるB細胞でのAKTの過剰リン酸化についての検討. (2016)
  • Author(s): 浅野孝基,岡田賢,津村弥来,小林正夫,葉姿文,今井耕輔,森尾友宏,関中佳奈子,辻田由喜,野々山恵章
  • Organizer: 第119回日本小児科学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-05-13 – 2016-05-15
• [Presentation] IKBA遺伝子異常による無汗性外胚葉形成不全症の一例. (2016)
  • Author(s): 鎌田亜希子,石毛崇,八木久子,滝沢琢己,荒川浩一,河合朋樹,今井耕輔
  • Organizer: 第119回日本小児科学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-05-13 – 2016-05-15
• [Presentation] 放射線感受性高IgM症候群原因遺伝子の同定. (2016)
  • Author(s): 今井耕輔
  • Organizer: 第119回日本小児科学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌（北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-05-13 – 2016-05-15
• [Presentation] Broad Spectrum of Clinical Manifestations and Outcome of Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Japanese Patients with Activated P13KD Syndrome Type1. (2016)
  • Author(s): Okano T, Imai K, Tsujita Y, Mitsuiki , Mitsui-Sekinaka K, Takashima T, Kanegane H, Nonoyma S.
  • Organizer: ASPID Spring School
  • Place of Presentation: 香港大学（香港）
  • Year and Date: 2016-04-29 – 2016-05-01
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] HYPER-IGM SYNDROMES DUE TO CSR DEFECTS-HOW TO TREAT ACCORDING TO GENETIC SUBTYPES? (2016)
  • Author(s): Imai K
  • Organizer: ASPID Spring School
  • Place of Presentation: 香港大学（香港）
  • Year and Date: 2016-04-29 – 2016-05-01
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] 遺伝学的検査・診断・遺伝カウンセリングの上手な進めかた (2016)
  • Author(s): 今井耕輔
  • Total Pages: 232
  • Publisher: 診断と治療社