microRNAセンサーベクターを用いた白血病幹細胞の同定と新規治療法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09652
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 平松 英文 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40362503)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: microRNA / 急性リンパ性白血病 / 白血病幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

小児急性リンパ性白血病のmicroRNAの発現プロフィール解析の結果に基づき（国立成育医療研究センター 清河 信敬先生）、同疾患で高発現が認められたmiR-146aを含む３つのmicroRNA をピックアップして、それぞれに対するmicroRNA sensing lentivirus vectorを作成した。このsensor vectorが細胞に導入されると 2 つのレポーター遺伝子である NGFR と GFP を発現するが、細胞内にターゲットの microRNA が存在すればvectorに組み込まれたmicroRNA binding siteを通して GFP の発現のみが低下し、フローサイトメトリーでGFPの蛍光強度を測定することにより、細胞内のmicroRNA発現レベルを半定量化できるシステムである。作成したsensor vectorを様々な白血病細胞株に感染させ、フローサイトメトリーによってGFP発現量をスクリーニングしたところ、ALL細胞株であるREH細胞においてmiR-146a発現に多様性があることを見出した。次に、REH細胞からmicroRNA-146a高発現分画と低発現分画をソーティングにより分取し、それぞれの生物学的差異について検討を行った。両分画は１ヶ月以上培養を続けてもmicroRNA-146a発現量に変化は見られず、互いの分画を生じることもなく、microRNA発現量が一定量に維持されていた。通常培養においては増殖曲線に差は見られなかったが、細胞数を減じてコロニーアッセイを行うと、microRNA-146a低発現分画において、有意にコロニー形成能が高いという結果が得られた。そこで、両者の細胞周期やアポトーシスについて解析を行ったが、有意な差は確認できなかった。また抗癌剤に対する薬剤感受性について検討を行ったが、有意な差は得られなかった。現在、microRNA発現の差がもたらす生物学的特徴の差につき、検討を重ねている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

先行研究でmicroRNA-126に対するsensor vectorを使用していたが、本研究では新たな候補microRNAに対するsensor vectorの作成から開始した。当初の計画通り、小児急性リンパ性白血病で高発現しているmicroRNAのリストから、広く高発現していた３つのmicroRNAに対するsensor vectorを作成することができた。これらのsensor vectorを使って簡便にsingle cell levelでのmicroRNA発現をフローサイトメトリーで観察することが可能になり、均一な集団と考えられている細胞株内でもmicroRNA発現の多様性があり得ることを見出した。これはmicroRNA sensing vectorを用いることによって初めて明らかにできた知見であり、今後生物学的意義について研究を深める重要なデータが得られたと考えている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、REH細胞を用いてmicroRNA-146aの高発現分画と低発現分画の生物学的差異についての検討をおこなう。次の計画としてはそれぞれの分画を免疫不全マウスであるNOGマウスへ移植して、生着性、増殖性に差がないかを検討する。また、両細胞集団で網羅的遺伝子解析を行い、有意に発現パターンの異なる遺伝子群を同定し、機能的差異を推定することを計画しいている。一連の検討は他の細胞株でも行って、microRNA-146aが細胞株内で持つ普遍的な機能を調べることを予定している。またそれらと並行して、microRNA-146a以外のmicroRNA sensing vectorを使って、他の候補microRNAに対しても同様の検討を行っていく。現段階では細胞株を用いた実験を中心に進めているが、今後、患者検体を用いて実際のヒト白血病細胞集団でのmicroRNA発現の多様性につき検討し、その生物学的意義を解析していく予定である。

Causes of Carryover

患者由来の白血病細胞を使用した研究に着手することができず、白血病細胞の分離や培養、フローサイトメトリーによる解析を行えなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

患者由来の白血病細胞を分離するための試薬や培養液、フローサイトメトリー用抗体の購入に使用する。