2016 Fiscal Year Research-status Report
ゼブラフィッシュを用いた先天性貧血発症の分子メカニズムの解明
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15K09656
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
上地 珠代 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 研究員 (10381104)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | リボソームタンパク質遺伝子 / 翻訳異常 / ゼブラフィッシュ / ダイアモンド・ブラックファン貧血 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ダイアモンド・ブラックファン貧血（DBA）は、リボソームタンパク質（RP）遺伝子の変異により発症すると推測される。患者の約半数で、16種類のRP遺伝子いずれかの変異が確認されたが、発症機序の解明は進んでいない。本研究では、ゼブラフィッシュのDBAモデルを用いて発症の分子メカニズムの解明に迫る。RP遺伝子の発現量の低下に伴って翻訳が抑制される遺伝子に着目し、リボソームがmRNA選択的に翻訳量の調節を行うと推測し、そのメカニズムの解明を目指す。
1. DBAモデルで翻訳効率が低下する遺伝子のin vivo機能解析
rps19遺伝子の発現抑制により翻訳効率が低下する遺伝子のなかに糖鎖修飾に関与する遺伝子が複数含まれていた（前年度）。その内、特に興味深い遺伝子のmRNAをin vitro合成し、ゼブラフィッシュのDBAモデル（rps19発現抑制胚）に注入した。その結果、発生遅滞などの形態異常は回復しなかったが、赤血球数が明らかに回復した。このことから、この遺伝子が造血において重要な役割を果たしていることが示唆された。
2. 患者型変異をもつモデルの作製
ゲノム編集技術を用いて、患者と同様のアミノ酸置換を含むRPを発現するモデルの作製を試みた。これまでの手法（gRNA、Casタンパク、一本鎖DNAを用いる）に替えて、より効率がいいとされる（gRNAに替えてcrRNAとtrcrRNAを組み合わせて用い、Casタンパクと一本鎖DNAを用いる）手法を試みた。その結果、目的の塩基置換をもつことが期待される個体（F0）を得ることができた。引き続き、飼育・観察を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
rps19遺伝子の発現抑制胚において翻訳効率が大きく低下した遺伝子を過剰発現させることで、赤血球造血が回復することを示すことができた。糖鎖修飾に着目した点は新規性が高く、発症機序の解明に向けて有用なデータが得られた。
また、患者型変異をもつモデルの作製するために、ゼブラフィッシュのゲノム編集に関して豊富な経験をもつ研究室の協力を得て、より効果的な手技・手法を確立できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト血球細胞由来の K562においてRP遺伝子（RPS19およびRPS15a）の発現をsiRNAにより抑制し、ゼブラフィッシュのDBAモデルで得られた結果と同様に、糖鎖修飾に関与するタンパク質が減少しているかどうかをウェスタンブロッティング法で確認する。また、ゲノム編集技術を用いた患者型変異をもつDBAモデルの確立を目指、現在飼育中のF0からF1の個体を得て、解析を進める。
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| Causes of Carryover |
国際学会および国内学会への参加費が、学会および大学から参加費支援を受けたことで予定していた金額を下回ったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ゲノム編集技術を用いたモデルの作製が順調に進んでいるため、引き続き博士研究員を採用する経費として未使用額を使用する。
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[Journal Article] Exome sequencing identified RPS15A as a novel causative gene for Diamond-Blackfan anemia.2017
Author(s)
Ikeda F, Yoshida K, Toki T, Uechi T, Ishida S, Nakajima Y, Sasahara Y, Okuno Y, Kanezaki R, Terui K, Kamio T, Kobayashi A, Fujita T, Sato-Otsubo A, Shiraishi Y, Tanaka H, Chiba K, Muramatsu H, Kanno H, Ohga S, Ohara A, Kojima S, Kenmochi N, Miyano S, Ogawa S, Ito E.
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Journal Title
Haematologica
Volume: 102
Pages: e93-e96
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] TBCD may be a causal gene in progressive neurodegenerative encephalopathy with atypical infantile spinal muscular atrophy.2017
Author(s)
Ikeda T, Nakahara A, Nagano R, Utoyama M, Obara M, Moritake H, Uechi T, Mitsui J, Ishiura H, Yoshimura J, Doi K, Kenmochi N, Morishita S, Nishino I, Tsuji S, and Nunoi H
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Journal Title
Journal of Human Genetics
Volume: 62
Pages: 473-480
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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