急性移植片対宿主病の病態解析及びその分子標的療法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09657
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 山本 雅樹 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80404664)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀 司 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (20398324) ; 斉藤 淳人 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (40749420) ; 五十嵐 敬太 札幌医科大学, 医学部, 助教 (70580017)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ケモカイン / CCL8 / 移植片対宿主病

Outline of Annual Research Achievements

背景：ケモカインCCL8はヒト及びマウスモデルにおいてGVHDのバイオマーカーとして期待されている。
これまでの我々の研究で、MHCの異なるマウス間での骨髄移植ではCCL8が血中に高濃度で検出され、GVHDの病勢、死亡率と相関する事が明らかとなっている。またin vitro CCL8発現系では、MHCの異なるマウスの脾臓細胞を混合培養（白血球混合培養）する事で培養上清中にCCL8タンパクが高濃度に発現する事を明らかにしている。
実験方法：CCL8 ノックアウトマウス細胞を用いた白血球混合培養系でのCCL8タンパク発現を評価した。
我々は、Zinc Finger nucleaseを用いてCCL8ノックアウトマウスを作製した。（Background はC57BL/6及びBalb/cマウスである）今回は、Stimulator（放射線照射を行って細胞増殖能をなくした脾臓由来白血球）とResponder (stimulatorからのallo抗原刺激を受けて、CCL8を発現すると考えられる脾臓由来白血球)をそれぞれ、wild typeとCCL8 KOマウスから調整し、白血球混合培養を行った。
結果：Stimulator （wild type C57BL/6）とResponder (wild type Balb/c)の組み合わせでは、培養上清中にCCL8タンパクを高濃度で検出した。(day6 1307.3pg/mL, 1883.9pg/mL)　一方、Stimulator (wild type Balb/c)とResponder (CCL8 KO C57BL/6)の組み合わせでは、syngeneic (stimulator, responderともwild type Balb/cの組み合わせと同程度のCCL8タンパク発現しか認めなかった。(day6 128.4pg/mL,231.3pg/mL)

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CCL8 KOマウスを使った実験は骨髄移植を優先として行っており、in vitroの実験に使用するKOマウスを確保できていなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後はwild type Balb/cとwild type C57BL/6の脾臓細胞による白血球混合培養系でのin vitro RNAiによりCCL8のmRNA発現knockdownを試みる。CCL8 KOマウス細胞を用いた白血球混合培養と、CCL8 knock downしたものとを比較して、in vitro RNAiの効果を判定する。

Causes of Carryover

realtime PCRに関わる消耗品の請求が年度末にかかり、次年度使用額が生じました。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度未使用額約20万円と28年度交付額180万円を合わせて、realtime PCRに関わる消耗品購入、マウスや試薬購入費として使用します。また今年度は学会参加、発表のためにも使用予定です。