2016 Fiscal Year Research-status Report

Siglec-9による活性化好中球細胞死誘導の分子学的機序とその臨床的意義の検討

Research Project

Project/Area Number	15K09661
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	加納原京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (50725306)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	Siglec誘導性細胞死 / 細胞内ROS産生機構 / NOXサブユニット
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、顆粒球（好中球・好酸球）表面に発現するシアル酸受容体Siglecがもらたす細胞死の分子学的機序、およびその臨床応用について検討している。Siglec刺激により細胞死に至る細胞内シグナル伝達系を同定することは、Siglec依存性の細胞死につながるため、初年度はこれに重点を置いて研究を行なった。その結果、免疫化学法による半網羅的解析により、Siglec刺激とSrc Family Kinase (SFK)のリン酸化に相関があることが示され、ついでSFK阻害剤によりSiglec誘導性細胞死が抑制されることが確認されたことから、SFKがSiglec誘導性細胞死に重要な役割を果たすことが明らかになった。さらに、Siglec誘導性細胞死は、ETosisなど他の顆粒球細胞死と異なり、細胞外ROSではなく細胞内ROS依存性であり、この細胞内ROS産生がSFK阻害剤で抑制されることから、SFK→細胞内ROS産生という機序が大きく関与していることが示唆された。この成果は、Immunobiology誌にて発表した。つづいて次年度では、細胞内ROS産生の首座を同定すべく、顆粒球内NADPH oxidase（NOX）の活性化に着目した。好酸球、好中球内ではNOX2が細胞内外ROS産生に寄与しているが、細胞内ROS産生にはNOXサブユニットのp40phoxが機能することが必須であるとの知見がある。このため、p40phox、p47phoxについてそれぞれWesternBlott法でリン酸化を検討したところ、Siglec刺激でp40phoxのリン酸化を認めた。しかしCa ionophoreを用いたETosis刺激の方が5分後のp40phoxリン酸化は顕著であり、Siglec刺激のほうがETosis刺激よりも細胞内ROS依存性であることの説明としては不十分でああり、さらなる検討を要する結果だった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 細胞内ROS産生の主たる機序としてp40phox活性化を想定していたが、現在までのところはこれを強く示唆するデータは得られておらず、むしろp40phoxは細胞外ROS優位に亢進させるETosis刺激でより活性化されるという、意外な結果であった。このため、結果の再現性についてより厳密な評価を要した。
Strategy for Future Research Activity	現時点ではp40phox、p47phoxとも、5、10分後のリン酸化を評価しているのみであり、phosphoflowを用いて経時的に観察した場合には違う評価になるかどうか、検討する。また、他のサブユニットであるgp91phoxについても、その表面発現に変化が生じるかを検討する。平行して、Siglec刺激、ETosisそれぞれで細胞死に際し放出される物質の免疫伝達物質としての作用を比較する。具体的には、細胞死の際の培養上清を単核球や培養樹状細胞に与えた場合の作用、またサイトカインパネルを用いた解析などを予定している。
Causes of Carryover	物品購入に際し、端数が生じたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	継続して、消耗品の購入に充当する。