2017 Fiscal Year Research-status Report
Siglec-9による活性化好中球細胞死誘導の分子学的機序とその臨床的意義の検討
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15K09661
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
加納 原 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (50725306)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | NOX2サブユニット / p40phox / gp91phox |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、顆粒球(好中球・好酸球)表面に発現するシアル酸受容体Siglecがもらたす細胞死の分子学的機序、およびその臨床応用について検討している。Siglec刺激により細胞死に至る細胞内シグナル伝達系を網羅的に検討したところ、Siglec刺激に伴いSrc Family Kinase (SFK)がリン酸化することが判明した。そして種々のSFK阻害剤添加によりSFK活性化を抑制するとSiglec誘導性細胞死が抑制されたことから、SFKのSiglec誘導性細胞死への関与が示された。さらにSiglec誘導性細胞死は、他の特徴的な顆粒球細胞死であるETosisと異なり、細胞外ROSではなく細胞内ROS依存性であり、この細胞内ROS産生がSFK阻害剤で抑制されたことから、SFK→細胞内ROS産生という機序の存在が確認された 。この成果は、Immunobiology誌に発表した。
次に細胞内ROS産生の機序を解明すべく、顆粒球内NADPHoxidaseであるNOX2の関与を検証した。NOX2サブユニットのうち、細胞内ROS産生との関連が示唆されているp40phoxの活性化について、リン酸化特異抗体を用いて評価したところ、Siglec-8刺激、ETosis刺激いずれもリン酸化を誘導したが、その程度は後者の方がより強かった。一方、NOX2は活性化の最終段階でその細胞表面発現が増加するため、これをgp91phox抗体を用いたFACSで比較したところ、SiglecではなくETosis刺激のみにおいて発現亢進が認められた。これは、Siglec刺激細胞ではp40phoxの会合が起こってもNOX2の細胞表面への移動は阻害されていることを示しており、同刺激が細胞外ROS非産生性となる機序が解明された。細胞内ROS産生亢進の機序については、ミトコンドリアの関与について検討をおこなっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
好中球／好酸球について、それぞれ表面レセプターSiglec-9／8を刺激することによる細胞死の分子学的機構とその臨床的意義を解明する研究であるが、Siglec-9については、これまでリガンドとして用いられていたモノクローナル抗体が販売中止となり、代替品の探索に想定以 上の期間を要した。また、末梢血からの好中球単離キットについても、より安定した結果を得るため溶血ステップを含まない製品の導入を選択したが、その評価過程でやはり想定以上の時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
Siglec誘導性好酸球細胞死における細胞内ROSの産生機序について、ミトコンドリアとSFKとの関連にも着目しつつ、解明を進める。新規のSiglec-9抗体による刺激プロトコールが確立できれば、これら好酸球で得られた知見が好中球にも適用されるかを同様の手法で評価する。
また、ROS産生部位の違いによる細胞微小環境への影響を評価するため、培養上清中のDAMPs活性物質の測定、上清液による樹状細胞刺激の検討もおこなう。また、より生理的な条件として、Siglecのリガンドであるシアル酸のうち、ヒトでの発現を認めないN-Glycolylneuraminic acidと、発現を認めるN-Acetylneuraminic acidでそれぞれ好中球／好酸球の刺激をおこない、両者を比較することによって生体防御における好中球と好酸球の本質的な違いについても検討を加える。
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| Causes of Carryover |
ヒト好中球表面レセプターSiglec-9を刺激することによる細胞死の分子学的機構を解明する研究である が、これまでリガンドとして用いられていたレセプター抗体が販売中止となり、代替品の探索に想定以 上の期間を要した。また、末梢血からの好中球単離キットについても、より安定した結果を得るため溶 血ステップを含まない製品の導入を選択したが、その評価過程でやはり想定以上の時間を要した。
次年度は、繰り越し資金を用いて当初の計画を完遂させる。
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