2015 Fiscal Year Research-status Report
神経芽細胞腫増殖におけるアンチザイム２とMYCNの相互作用の解析
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15K09666
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
村井 法之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60300927)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | MYCN / 神経芽細胞腫 / アンチザイム / プロテアソーム / ユビキチン非依存的分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究でc-MYCがアンチザイム2（AZ2）によってユビキチン非依存的にプロテアソームで分解されることを見いだしたことから、神経芽細胞腫で高発現しているMYCNについてもc-MYCと構造が非常に類似しているため同様に分解すると考え、細胞内における分解実験を行なった。神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にHAタグを付加したMYCNを単独あるいはAZ2と共発現させ、タンパク合成阻害剤シクロヘキシミド添加によるMYCNの分解実験を行なったところ、AZ２が存在すると明らかにMYCNの分解が促進された。さらにsiRNAを用いてAZ2遺伝子ノックダウンを行い内在性MYCNの分解を解析すると、ネガティブコントロールのsiRNAで分解されていたMYCNが、AZ2をノックダウンするとその分解が抑制された。これらのことは、c-MYCと同様にMYCNもAZ2によって分解促進されることを示唆している。
また、神経芽細胞腫の細胞株を数種培養し内在MYCNおよびc-MYCタンパク質の発現を比較した。これらの細胞株ではMYCNのみが優位に発現しているもの、両者が高発現しているもの、また両者が低発現のものに分類された。さらにAZ2のmRNAの発現も解析すると発現の細胞株と高い細胞株が存在した。今後細胞の種類を増やし、AZ2の発現とMYCN、c-MYCの発現の相関について解析する予定である。AZ2のMYCN分解へや神経芽細胞腫の増殖との関連を解析するためにAZ2ノックアウト細胞を作製を開始した。作製に必要なガイドRNAや塩基配列解析のためのプライマーの設計等を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
27年度の実験計画では、MYCNとAZ2の細胞内局在解析を行うことになっていたが、研究以外の業務が一時的に増加したため、実行することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
若干の研究計画進行の遅れはあるが、ポジティブな結果が得られているので、28年度は研究速度をやや速めて計画通りのスピードとなるように調整する予定である。まず27年度に遂行予定であったAZ2とMYCNの局在や相互作用のプルダウンアッセイを行う予定である。またなるべく早期に、AZ2をノックアウトした神経芽細胞腫細胞株を樹立し、増殖・浸潤・転移能の解析を行いそれらとの関連を明らかにしたい。このノックアウト細胞については、28年度で可能であればメタボローム解析や遺伝子発現の網羅的解析も進めていきたい。また何種類かの神経芽細胞腫細胞株を培養しAZ2のmRNAの発現レベルのちがいにより細胞内の遺伝子発現や一部のタンパク質にどのような違いがあるか解析する予定である。この解析には、最初はがんや細胞増殖関連遺伝子を中心に解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
ゲノム編集による遺伝子ノックアウト細胞の作製開始が２月下旬になったため、それに伴う試薬の購入が27年度の会計処理に間に合わなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
２月から３月にかけてゲノム編集の試薬や神経芽細胞腫の細胞を購入し27年度使用予定に近い額を使用した。２８年度は実験計画通りに使用予定である。また９月国際学会での発表を予定している。
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[Journal Article] Polyamine regulating protein antizyme binds to ATP citrate lyase to accelerate acetyl-CoA production in cancer cells2016
Author(s)
Tajima, A., Murai, N., Murakami, Y., Iwamoto, T., Migita, T.,Matsufuji, S.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 471
Pages: 646-51.
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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