2015 Fiscal Year Research-status Report
おとりRNAを利用したパラミクソウイルスの新規治療戦略に関する研究
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15K09672
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
原 好勇 久留米大学, 医学部, 准教授 (40309753)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柏木 孝仁 久留米大学, 医学部, 講師 (70320158)
渡邊 浩 久留米大学, 医学部, 教授 (90295080)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | パラミクソウイルス / RSウイルス / 非翻訳領域 / RNP / ルシフェラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では抗パラミクソウイルス薬を開発することを目的としている。ウイルス遺伝子の両末端に存在するパラミクソウイルス共通の非翻訳領域に着目し、この領域を模倣した「おとりRNA」が抗ウイルス薬として利用できないか検討を開始した。初年度の計画として、まず「おとりRNA」の抗ウイルス作用を簡便に評価できる実験系の確立に主眼を置いた。パラミクソウイルスは細胞に感染した後、細胞内でウイルスの本体である核酸タンパク質複合体「RNP」を形成する。その後RNPを細胞膜で包み込みながらウイルス粒子を完成させ細胞外へと放出する。抗ウイルス薬の阻害効果を評価する場合、細胞外に放出されたウイルス粒子を従来のプラークアッセイで直接定量するよりも、迅速性と簡便性を求めるなら細胞内にできたRNPを定量する方が優れている。また抗ウイルス薬の作用機序を詳細に検証できる利点がある。そこでパラミクソウイルスのRNPを細胞内で形成させるプラスミドの構築を目指した。またウイルスの内部遺伝子を全て削除し両末端の非翻訳領域だけを残し、代わりにルシフェラーゼ遺伝子を内部に組み込むことでRNPの複製量をルシフェラーゼの発光強度で定量できるようにした。最初にパラミクソウイルスの一つであるヒトメタニューモウイルスで実験を行ったが、ルシフェラーゼ活性が非常に弱く良い結果が得られなかった。そこでフランスのEleouet博士に共同研究を申し込み、彼らがパラミクソウイルスの一つであるRSウイルスで構築したRNPの定量プラスミドを分与頂いた。現在、プラスミドを大量精製し、非常に強いルシフェラーゼ活性が得られることを確認した。とりあえず当初の計画であった実験系の確立ができたので、今後「おとりRNA」を作成し抗ウイルス効果を評価していく計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の計画は抗ウイルス作用を簡便に評価できる実験系の確立であった。本研究で独自の実験系を確立するつもりであったが、用いたヒトメタニューモウイルスでは強いルシフェラーゼ活性が得られなかった。また原因も分からなかったためこのままでは実験系の確立は難しいと判断し、他研究室から援助を仰ぐことにした。国際ネガティブストランドウイルス学会に出席した際に共同研究先を探し、面識がないにもかかわらずEleouet博士（仏）に快諾して頂いた。分与して頂いたRSウイルスのRNP定量プラスミドを当研究室で大量精製し、培養細胞を用いた予備実験で強いルシフェラーゼ活性が検出でき、確実に実験系が動くことを確認することができた。プラスミドを分与される形にはなったが、とりあえず当初の計画である実験系確立の目標は達成できた。抗ウイルス作用を評価できる実験系としては非常に強力な実験系であることが確認でき、今後「おとりRNA」の抗ウイルス効果を評価していくつもりである。
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| Strategy for Future Research Activity |
共同研究先から入手した実験系を用いて、予定通り「おとりRNA」の抗ウイルス効果を評価していく計画である。3‘末端および5’末端の約50～100塩基の非翻訳領域RNA、いわゆる「おとりRNA」を発現するプラスミドを作り培養細胞に導入し抗ウイルス活性を測定する。製剤化を目指すには「おとりRNA」は短ければ短いほど良いため、欠損変異体作成法によりPCRを用いて両末端を約10塩基ずつ欠失させた変異体を作成していく。同時に抗ウイルス活性を測定し、活性が維持される最小の長さである「コア領域」までRNAを短縮化する。短縮化に成功したら、その「おとりRNA」を人工合成し、実際にウイルスを感染させた培養細胞で抗ウイルス活性を測定する。ウイルスはRSウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルスを用いる。そして最終的にマウスを使った動物実験により、抗ウイルス薬としての有効性を検証する。
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| Remarks |
久留米大学医学部感染制御学講座
http://www.med.kurume-u.ac.jp/med/virol/
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