2015 Fiscal Year Research-status Report
慢性肉芽腫症における炎症制御異常の機序および遺伝子治療に関する検討
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15K09677
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| Research Institution | National Center for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
河合 利尚 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (20328305)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小野寺 雅史 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (10334062)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 慢性肉芽腫症 / 炎症 / 原発性免疫不全症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
原発性免疫不全症である慢性肉芽腫症(CGD)では、過剰な炎症反応が遷延し炎症性肉芽腫をきたす。詳細な機序は明らかでないが、CGDの原因であるNADPHオキシダーゼの活性酸素種（ROS）産生障害による炎症制御異常との関連が示唆される。そこで、本研究では炎症を制御する単球／マクロファージのROSに関連する炎症シグナルについて検討している。
単球／マクロファージはNADPHオキシダーゼを発現するが、免疫応答に関与するリンパ球（T細胞、B細胞）やNK細胞はNADPHオキシダーゼをほとんど発現していない。そのため、CGDに特徴的な過剰炎症の過程で、単球／マクロファージが中心的役割を果たしていると考えられた。そこで、ROSを全く産生しない典型的なX連鎖CGD患者と、好中球でのROS産生は残存するが単球／マクロファージ特異的にROS産生能が低下する患者（M特異的ROS低下患者）に注目した。この２例は、いずれも幼少時から細菌性肺炎を発症し、幼児期に炎症性腸疾患に類似したCGD腸炎（肉芽腫性腸炎）を発症している。NADPHオキシダーゼ構成蛋白の一つであるgp91phoxをコードするCYBB遺伝子を解析したところ、典型的なCGD患者ではnull変異、M特異的ROS低下患者ではミスセンス変異を認めた。これらの患者単核球からCYBB遺伝子のcDNAを作成し、GFPを共発現するレトロウイルスを介してK562細胞株へ遺伝子導入した。Flow cytometryを用いてgp91phox発現を検討したところ、K562-null変異CYBBでは発現を認めなかったが、K562-ミスセンス変異CYBBでは野生型CYBBよりも発現は低下しているが、gp91phoxの発現を認めた。ケミルミネッセンスを用いてROS産生能を検討したところ、K562-ミスセンス変異CYBBではわずかにROS産生が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は研究期間３年間の１年目であり、実験系と細胞株の樹立を行った。スクリーニングとして行った簡易実験では、作成した遺伝子導入細胞（K562）は患者のprimary cellの表現系を示す可能性が示唆された。詳細な解析については、次年度に実施する予定であるが、単球からマクロファージへ誘導した後の機能解析については、さらなる実験系の改善が必要と考える。現段階で、マクロファージへ誘導する際に用いるサイトカインが、細胞機能の解析に影響している可能性があるため、解析方法を再検討している。
研究全体としては概ね予定通り進んでいるが、マクロファージの解析については予定よりやや遅れており、実験系の樹立は次年度も継続して行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、今年度に作成した遺伝子導入K562細胞株を用いて、CYBB遺伝子のmRNAの安定性について検討する。末梢血単核球では、CYBB遺伝子のmRNA発現レベルは正常遺伝子とミスセンス変異の遺伝子で有意な変化は認めなかった。しかし、gp91phox発現レベルでは、ミスセンス変異に関連すると思われる低下が確認された。そこで、mRNAの安定性についてBrdUを用いたRNA安定性試験等を行い、蛋白発現低下の機序について検討する。
さらに、当初の予定通り、患者単球／マクロファージを用いて、in vitro培養条件下でのToll-like receptor、サイトカイン、zymosan刺激に対する炎症性サイトカイン産生能と、ATPなどDAMPsによるプライミング効果を、サイトカイン産生能を指標に検討する。
また、2014年に当センターではCGD患者に対してレトロウイルスを用いた遺伝子治療を行った。遺伝子治療後のCGDに特異的な単球／マクロファージの機能異常について、レトロウイルスで遺伝子導入された単球を用いて検討する予定であった。しかし、今年度の解析では、遺伝子導入細胞の著明な低下を認め。そこで、遺伝子導入細胞の機能を評価することは困難であるが、臨床的に慢性炎症の改善が得られるのか、フローサイトメトリ解析やベクターコピー数解析に基づいて検討を行う。なお、遺伝子治療の新たな被験者に対しては、当初の単球機能解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度の研究成果について、平成28年5月にアメリカで開催される米国遺伝子治療学会で発表することになった。そのため、平成27年度の経費でこの国際学会へ参加する予定であるが、旅費や発表資料作成費の引き落とし手続き（事務手続き）が平成28年度（平成28年4月以降）になるため、次年度使用額として計上することになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年5月にアメリカで開催される米国遺伝子治療学会で発表することになった。そのため、研究分担者とともに、この国際学会へ参加するための旅費や発表資料作成費として使用する予定である。
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