胸部大動脈瘤破裂をきたす遺伝性疾患治療を目指した血管平滑筋細胞分化機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09683
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 鈴木 信周 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任助教 (90247007)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川村 猛 東京大学, アイソトープ総合センター, 准教授 (70306835) ; 小笹 徹 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任教授 (70202059) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 血管平滑筋細胞分化 / Gα12/13 / RH-RhoGEF / リン酸化修飾 / Rho活性化調節

Outline of Annual Research Achievements

低分子量G蛋白Rhoは血管平滑筋細胞（SMC）分化・ 増殖の調節において重要な役割を果たすと考えられているが詳細は不明である。本研究では、SMC分化・ 増殖促進の際に、Rho活性化の強力なドライバーである三量体G蛋白、G12/13~ RH-RhoGEF（guanine nucleotide exchange factor containing RGS (regulator of G protein signaling)-homology domain: RHドメインを有するRho活性化因子、Leukemia-associated RhoGEF（LARG）、PDZ-RhoGEF、p115RhoGEFの三種）シグナル伝達機構が、どの様に作動しているのかを解明して、遺伝性大動脈瘤治療の基盤を作っていく。SMC分化促進に重要なシグナルを同定するために、マウス中胚葉由来多能性細胞10T1/2 をtransforming growth factor β (TGFβ)で分化させ、独自に開発したGα12とGα13に対する高感度特異的モノクローナル抗体を用いて、経時的にショットガンプロテオミクスを行った。ここで、今まで生理機能の違いが不明であった、Gα12とGα13が、分化の過程でそれぞれ全く違ったシグナル複合蛋白を構成する事が解った。特に、Gα12のリン酸化が、分化促進において重要な役割を果たしていることもわり、リン酸化部位の同定に成功した。Gα12リン酸化を模擬する蛋白変異体を作製し、様々な標的分子との結合の変化について検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

10T1/2 をTGFβで分化させる系を、Gα12とGα13抗体を用いて経時的にショットガンプロテオミクスを行い比較することで、SMC分化に重要なシグナルを同定することができた。SMC分化促進の際に、様々なRH-RHoGEFが、時間空間的に異なった役割を持つことがわかってきた。一方で、SMC分化促進に重要なG蛋白のリン酸化部位も同定できた。そこで、リン酸化Gα12と、様々な標的分子の結合をin vitroで解析した。この結果、Gα12リン酸化により、シグナルが活性化される機序が見えてきた。

Strategy for Future Research Activity

10T1/2細胞をTGFβでSMCに分化させる系を用いて、分化の際に形成されるGα12/13を起点とする複合体蛋白をショットガンプロテオミクスで経時的に追跡して、活性化シグナル経路を同定していく予定である。大動脈瘤形成・治療のモデルとして、TGFβ過剰投与、ARB投与を行い、上記シグナルの変化を理解し、治療の標的分子を決定していく。H27年度に同定された分化に関与するG12、G13シグナルの標的分子をsiRNAによってノックダウンする事で、Rhoの活性やSMC分化にどの様な影響がでるかを探る。更にG蛋白質のリン酸化・脱リン酸化によるRho活性制御メカニズムについて、蛋白再構築系や細胞系で解析する。リン酸化G蛋白を疑似する変異体を作製し10T1/2細胞に強制発現して、SMC分化に対する影響を調べる。

Causes of Carryover

当初の予想には反して、SMC分化において、G蛋白質のリン酸化が作動することが明らかになり、本年度はその部位の同定と、その他ターゲットとの結合・活性化実験に集中した。同定には、ショットガンプロテオミクスと、Sf9細胞～bavulovirus系を利用した、蛋白再構成実験を利用した。比較的費用のかかる、siRNAの実験は次年度に先延ばしとした。そのため、次年度に研究費の使用計画を繰り越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

繰越金は、新たに同定された、分化に重要なG12、G13シグナル標的分子のsiRNA実験の費用として使用される。Sf9-baculo virusの系を用いた蛋白調製のために使用される。リン酸化変異体蛋白質精製のためのバキュロウイルス作製、細胞維持のための費用として使用される。更に、リン酸化実験やRhoA活性化解析のためのアイソトープ購入のための費用に使用される。

Research Products

• [Journal Article] Targeting gene expression to specific cells of kidney tubules in vivo, using adenoviral promoter fragments. (2017)
  • Author(s): Sumiyo Watanabe , Toru Ogasawara, Yoshifuru Tamura, Taku Saito, Toshiyuki Ikeda, Nobuchika Suzuki, Tatsuo Shimosawa, Shigeru Shibata, Ung-il Chung, Masaomi Nangaku, Shunya Uchida
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12 Pages: 1-14
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0168638
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant