2016 Fiscal Year Research-status Report
致死性不整脈を合併する心筋緻密化障害の網羅的遺伝子解析と発症機序の解明
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15K09685
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
市田 蕗子 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (30223100)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西田 尚樹 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (10315088)
木下 耕史 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (10585920)
畑 由紀子 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (30311674)
小澤 綾佳 富山大学, 附属病院, 診療助手 (40596540)
廣野 恵一 富山大学, 附属病院, 助教 (80456384)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 心筋緻密化障害 / 遺伝子解析 / サルコメア遺伝子 / i PS細胞 / 突然死 / 次世代シーケンサー / 致死性不整脈 / 心筋細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心筋緻密化障害は、心室壁の過剰な網目状の肉柱形成と深い間隙を特徴とした心筋症で、難治性心不全や致死性不整脈の合併が高率にみられ、予後は不良である。心筋緻密化障害は、2006年AHAの提唱では、遺伝的要素が強い心筋症のカテゴリーに分類されているが、QT 延長症候群やカテコラミン感受性多形性心室頻拍などのイオンチャネル病も、同じカテゴリーに分類されている。私共も、心筋緻密化障害において、イオンチャネルのSCN5A遺伝子が合併する不整脈と密接な関連があることを報告した。本研究では、これまでの心筋緻密化障害の臨床遺伝学的研究の集大成として、Ⅰ.次世代シーケンサーを用いて、胎児心筋の発達や致死性不整脈にかかわる約80の遺伝子に関して網羅的解析を行い、Ⅱ.遺伝子異常が判明した患者由来のinduced pluripotent stem cell(iPS細胞）を樹立し、Ⅲ.iPS細胞から分化誘導した心筋細胞を用いて増殖分化能や機能解析を行い，心筋緻密化障害と高率に合併する致死性不整脈の発症機序を明らかにすることが、研究目的である。
H27,28年度は、次世代シーケンサーを用いて、網羅的遺伝子解析を行った結果、日本人心筋緻密化障害患者の30％にサルコメア遺伝子異常が認められた。また、変異のない患者群に比較し、変異を有する例では、有意に予後不良であり、特に二重変異の見られる症例は、致死性不整脈や心移植のリスク因子であることが判明した。
H29年度は、遺伝子変異を有する患者由来のiPS細胞から心筋細胞を誘導し、機能解析を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27,28年度は、次世代シーケンサーを用いて、網羅的遺伝子解析を行った結果、日本人心筋緻密化障害患者の30％にサルコメア遺伝子異常が認められた。また、変異のない患者群に比較し、変異を有する例では、有意に予後不良であり、特に二重変異の見られる症例は、致死性不整脈や心移植のリスク因子であることが判明した。
患者血液サンプルからiPS細胞の樹立：採取したサンプルから、レンチウィルスベクターにより細胞のリプログラミングに必要な因子（Oct3/4, Sox2, Klf4,c-Myc）を遺伝子導入し、iPS細胞を作成した。得られたiPS細胞については機能解析で未分化性を確認の上、心筋細胞への分化に用いた。まず、全ての株からDNAを抽出しシーケンスを行い、患者に由来するiPS細胞に探索された遺伝子の変異が改変されていないことを確認し、さらに免疫蛍光染色法、リアルタイムPCR等により、樹立した全てのiPS細胞が万能性を示すことを確認した。また、テラトーマ形成実験により、三胚葉全ての細胞へと分化する能力を持つことを明らかにし、さらには、核型分析を行い、樹立したiPS細胞に染色体異常のないことを確認した。
iPS細胞から心筋細胞への分化誘導; iPS細胞を、Bone Morphogenetic Protein (BMP)およびその内因性阻害因子であるActivin A、basic Fibroblast growth factor、Wnt賦活剤および阻害剤を用いて、心筋細胞へと分化誘導した。
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| Strategy for Future Research Activity |
患者iPS細胞由来心筋細胞の機能評価を行う。
iPS細胞由来心筋細胞の分化能評価：野生株と患者由来株の間で分化能および形態的な表現において差異を生じるか、遺伝子発現レベルおよび蛋白の発現レベルを評価する。遺伝子発現レベルはreal-time RT-PCRにて野生株と患者由来株iPS細胞由来心筋細胞のTnnTやNKX2.5などの心筋特異的mRNAの発現を比較検討する。蛋白の発現レベルは免疫蛍光染色およびウェスタンブロット法にて野生株と患者由来株iPS細胞由来心筋細胞のTnnTやNKX2.5などの心筋特異的蛋白の発現を比較検討する。
iPS細胞由来心筋細胞の増殖能およびアポトーシスの評価：野生株と患者由来株の間で増殖能およびアポトーシスに差異を生じるか、Flow cytometry法と免疫組織染色を行い評価する。増殖能に関しては、iPS細胞由来心筋細胞をBrdUにて数時間培養し、BrdUを取り込ませた上で、細胞を回収し、抗BrdU抗体を用いて、BrdU陽性細胞と非BrdU陽性細胞の比率を算出し、野生株と患者由来株間で比較検討する。アポトーシスに関しては、TUNEL法を用いて、免疫染色を行い、野生株と患者由来株間で差異がないか解析する。
iPS細胞由来心筋細胞の電気生理学的機能測定：iPS細胞由来心筋細胞からパッチクランプ法記録を行い、野生株と患者由来株の電気生理学的性質を比較し、催不整脈性の有無を検討する。さらに、iPS細胞由来心筋細胞に蛍光カルシウム・イメージング法を適用し、心筋の収縮能に必要な細胞内カルシウムの動態を野生株と患者由来株で比較する。
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| Causes of Carryover |
実験は計画どうりに進行しているが、残金がわずかに残った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後実験を急ぐ予定である
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[Journal Article] Long-term prognosis of patients with Left Ventricular Noncompaction: A Comparison between Infantile and Juvenile Types2017
Author(s)
Wang, Ce; Takasaki, Asami; Ozawa, Sayaka; Nakaoka, Hideyuki; Okabe, Mako; Miyao, Nariaki; Saito, Kazuyoshi; Ibuki, Keijiro; Hirono, Keiichi; Yoshimura, Naoki; Yu, Xian; Ichida, Fukiko
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Journal Title
Circ J
Volume: 81
Pages: 694-700
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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