動脈管酸素感受性と収縮弛緩制御におけるヒートショックタンパク質の役割

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09730
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 動脈管 / HSP70 / HSP27

Outline of Annual Research Achievements

本研究のターゲットであるHSP70には、近似のアミノ酸配列を持つHSP70ファミリーメンバーが多数存在する。満期胎仔の動脈管に高発現するHSP70種を確定すべく、昨年度から検討を重ねた結果、HSPA1であることを突きとめた。
すなわち、mRNAの発現定量実験の結果などから候補としたHSPA2, HSPA8, HSPA1（家兎）の全コード領域のクローニングを実施し、大腸菌発現用ベクターに挿入した。それぞれのHSP70を10xHis-融合タンパク質として大腸菌を用いて発現し、ニッケルビーズアフィニティカラムを用いて精製した。動脈管に発現するHSP70を検出する市販のモノクローナル抗体（W70）を用いて、これら3種類の発現HSP70のウェスタンブロットを検出したところ、HSPA1のみを検出した。よって、家兎満期胎仔動脈管に発現するHSP70は、HSPA1であることが明らかとなった。これらの3種類のHSP70を抗原として用いてマウスポリクローナル抗体を現在調製しており、免疫染色やウェスタンブロットなどの際の免疫的検出や、相互作用するタンパク質を検索するための免疫沈降などの実験に供する予定である。また、W70抗体で検出するHSP72 (HSPA1が、コードするタンパク質の一般名)のエピトープを部分欠損変異を入れた発現HSP72などを用いて決定する予定である。
次年度は、引き続きHSPA1（HSP72）の動脈管における役割・機能について、アポトーシス抑制作用や抗酸化作用のシグナル伝達を中心に検討を進め、動脈管ストレスとHSP27のリン酸化の関係についての研究も進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

動脈管に発現するHSP70種の決定に思いの外時間がかかってしまった。
この部分を明らかにしなければ、先にすすめないことから、仕方が無い事情ではあった。
このため、全体に実験計画が遅延ぎみになってしまった。

Strategy for Future Research Activity

3種類のHSP70のマウスポリクローナル抗体を近く入手できることから、HSP72と相互作用するタンパク質を検索するための免疫沈降実験を実施する。また、W70抗体で検出するHSP72のエピトープを部分欠損変異を入れた発現HSP72などを用いて決定したい。HSP70は、プロスタグランジンにより誘導され、抗酸化作用をもつ。HSP70は、IkBと結合しNF-kB パスウェイを抑制することにより抗炎症作用を示し、アポトーシスを抑制する。活性酸素種は、HSP70の発現を活性化させる。HSPA1（HSP72）の動脈管における役割・機能について、プロスタグランジンや活性酸素の影響下におけるHSP72の増減、局在の変動などを検出することにより、探索していく。また、動脈管ストレスとHSP27のリン酸化の関係についての研究も進める。