2015 Fiscal Year Research-status Report
復帰変異モザイクを応用したiPS細胞による表皮水疱症の治療
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15K09753
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤田 靖幸 北海道大学, 大学病院, 講師 (80374437)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 宏 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00146672)
乃村 俊史 北海道大学, 大学病院, 助教 (50399911)
夏賀 健 北海道大学, 大学病院, 助教 (70645457)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 表皮水疱症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
表皮水疱症（EB）は、表皮-真皮境界部を構成する蛋白の先天的欠損や構造異常により、容易に水疱や潰瘍を形成する遺伝性皮膚疾患である。表皮水疱症に対する細胞療法のうち、間葉系幹細胞（MSC）は非常に容易に培養・維持することが可能である。MSCは皮膚構成細胞に分化しうるため、EBに対する現実的な細胞療法のリソースとしてきわめて有望である。しかしながらEBは先天性疾患であるため、根本的治療を実現可能なMSCは他人由来になることから、数ヶ月程度で体内から排除されるという問題がある。
そこで、後天的に一部の皮膚で遺伝子異常が修復される現象（復帰変異モザイク）に注目した。このような部位から正常蛋白を産生する角化細胞を採取し、iPS細胞を作成した上でMSCへ分化・培養させ、病変部皮膚へ投与する方法を発想するに至った。
まず、重症EB患者から皮膚組織を採取、角化細胞を培養し、センダイウィルスベクターを用いて患者由来iPS細胞の樹立を試みた。この細胞は免疫染色・Alkarine phosphatase染色、RT-PCRおよびDNA methylation assayで幹細胞性を示し、in vitro分化実験および奇形腫形成実験により多分化能を示した。さらにこのiPS細胞から線維芽細胞および表皮角化細胞への分化能を確認した。
次に今回樹立されたEB患者由来iPS細胞から、Mutant Allele Specific Amplification(MASA)を用いて復帰変異モザイクを生じたクローンの選別を試みたが、条件を満たすiPS細胞クローンは得られなかった。そこで、健常人および復帰変異モザイクを生じていないEB患者から樹立したiPS細胞を用いて、MSCへの分化誘導を試みたところ、間葉系分化をin vitroで示し、CD73+CD90+Lineage-を示すMSCとして妥当な細胞であることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
患者由来も含めた表皮角化細胞からのiPS細胞の樹立、およびMSCへの分化誘導は順調に実現することが可能であったため、おおむね順調に実験は推移している。復帰変異モザイクを伴うクローンが現時点で得られていないため、平成28年度以降も引き続き取り組む予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
復帰変異モザイクを伴うiPS細胞クローンが現時点で得られていないため、平成28年度以降も引き続き取り組む予定である。また、患者由来末梢血や骨髄由来細胞からの導入も検討する。どうしても復帰変異モザイクを伴うiPS細胞クローンが得られなかった場合は、当初の研究計画通り、患者由来（復帰変異モザイクを伴わない）の角化細胞および健常人角化細胞からのiPS細胞からMSCを分化誘導させ、今後の実験系を進める。
このように作成されたMSCは、MSCたりうるためのminimal criteriaを満たしているものの、樹立過程が通常のMSCとは全く異なるため、遺伝子プロファイルやEBなど皮膚疾患に対する治療可能性も異なる可能性がある。そこで、市販の骨髄由来MSCや、樹立過程の角化細胞・iPS細胞などと遺伝子発現プロファイルを比較し、皮膚基底膜蛋白の発現についてもRT-PCRや免疫染色で検討する。
これらを検証した上で、ヒト細胞が生着し異種移植実験が可能な免疫不全scidマウスの背部に全層創傷を作成し、上記で作成されたMSCを局所注射、ないし経静脈投与する。創が上皮化した時点で皮膚組織を採取し、ヒトHLA-classI陽性皮膚構成細胞の存在率を免疫染色やフローサイトメトリー等で解析する。また、ヒト皮膚基底膜蛋白の発現について免疫染色・RT-PCR・Western blottingで確認する。
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| Causes of Carryover |
動物実験施設の稼働が学内の都合により遅延し、マウスの繁殖に時間を要したことから、マウス投与実験の準備に見込んでいた細胞を樹立する必要が当初の予定よりも少なくなった。そのため培地等も含めた消耗品費の消費も当初の計画よりも少なくなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
動物実験施設は平成28年度は現時点で順調に稼働し、マウス投与実験も予定通り実施できる可能性が高いことから、その分の消耗品費を平成28年度以降で使用する予定である。
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