表皮初期発生制御におけるADAMTS-2の機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09758
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 高崎 真美 筑波大学, 医学医療系, 特任助教 (80392009)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 表皮発生 / 多能性幹細胞 / 再生医学

Outline of Annual Research Achievements

これまでの研究により、無血清培地中で浮遊培養したマウスES細胞塊をTGF-bスーパーファミリーに属するBMP4タンンパク質の存在下にて接着培養することで、高い効率で表皮幹細胞への分化を確認した。表皮幹細胞への分化は、形成した細胞塊をファイブロネクチン上で接着させることが必須であり、浮遊状態のままやラミニン上での接着培養では効果が見られなかった事から、表皮幹細胞分化における細胞外マトリックスの特異性が示唆された。
これまでに、BMP4存在下または非存在下において、表皮幹細胞に分化途中のES細胞で遺伝子発現の比較を行った。その結果、コラーゲンの成熟を制御し、細胞外マトリックスの再構成に関与すると予想されるメタロプロテアーゼADAMTS-2を同定した。ADAMTS-2は、ヒトにおいて皮膚の脆弱性をおこす難病エーラスダンロス症候群の原因遺伝子の一つともされているが、初期発生における表皮への運命決定との関連については報告が無い。経時的なPCR解析を行ったところ、ADAMTS-2の発現開始時期が表皮幹細胞のマーカー発現より先行していることが明らかとなった。このことは、表皮への運命決定においてメタロプロテアーゼが新規機能を果たす可能性を示唆している。
平成28年度は、哺乳類の表皮発生を制御する因子としてADAMTS-2の機能解析を進めるため、ノックダウン法によるADAMTS-2の機能阻害実験を行い、表皮幹細胞への分化に与える影響について検証した。さらに、マウスでの分化条件をヒトES／iPS細胞に応用することで、ヒト表皮幹細胞分化実験を行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

リコンビナントBMP4の効果にロット差がある影響で、表皮分化の誘導効率が一定しないという問題が続き、結果に振れが生じることで実験の遅れに繋がっている。
また、マウスES 細胞での分化条件が、ヒトES/iPS細胞においてはそのまま当てはまらないことがあり、条件検討に予想より時間を費やしていることも挙げられる。

Strategy for Future Research Activity

今後、重点的に推進する研究課題は、ヒトES/iPS細胞の表皮幹細胞分化条件の最適化である。これまでマウスES細胞と同様の手法をヒト細胞の実験に応用していたが、ヒト多能性幹細胞においては初期状態がマウスES細胞と異なる可能性を考え、サイトカイン・低分子化合物の添加時期のさらなる詳細な検討を進めて行く。
また、主にshRNAによるノックダウンiPS 細胞株の樹立を試み、ヒト表皮分化におけるADAMTS-2の機能解析を推進する。リコンビナントタンパク質のロット差改善策として、低分子化合物による代替法へのスイッチングも模索する。