2015 Fiscal Year Research-status Report
フィラグリン遺伝子変異が角化細胞に与える影響についてヒトiPS細胞を利用する試み
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15K09759
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
井川 健 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (00372441)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 人工ヌクレアーゼ / 表皮角化細胞 / フィラグリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① ヒトiPS細胞のおいてkeratin遺伝子にeGFP遺伝子をノックインする
現状で確立されているiPS細胞から表皮角化細胞誘導システムは、未だ改善の余地がある。本研究においては、表皮角化細胞への分化誘導を厳密にチェックしながら研究を遂行していくことを考え、ヒトのiPS細胞において、内在性のK5あるいはK14遺伝子に、インフレームでeGFP遺伝子をノックインした。この際には、人工ヌクレアーゼ（TALENs）を利用した。このシステムでは、iPS細胞が角化細胞に分化しK5/K14遺伝子がONになってくると、GFPの蛍光発色も同時に観察されるようになる。このGFPの発現強度は、内在性のプロモーターに依存することになるため、蛍光強度でkeratin遺伝子の発現の程度に見当をつけることも可能である。
② ヒトiPS細胞におけるフィラグリン遺伝子のターゲッティング
ヒトiPS細胞における遺伝子のターゲッティングは、マウスESあるいはiPS細胞におけるそれに比してかなり困難とされているが、我々はすでにTALENsやCRISPR/Cas9などの人工ヌクレアーゼを作製し、それを利用することにより、ヒトiPS細胞においてもいくつかの遺伝子のターゲッティングに成功している。その際、片アレルのみのターゲッティングのみならず、両アレルのターゲッティングにも成功している（unpublished data）。そのシステムを利用して、フィラグリン遺伝子を標的にして、ターゲッティングを行なった。①において得られた、K14/K5-eGFP-ヒトiPS細胞、正常なiPS細胞を使用して行った。人工ヌクレアーゼとしてはCRISPRを利用した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
いまのところほぼ予定通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
フィラグリン遺伝子KO－ヒトiPS細胞（K14/K5-eGFP）とそのペアとなるターゲッティングを行っていないヒトiPS細胞（K14/K5-eGFP構築は保持。controlヒトiPS細胞）について、すでに確立している表皮角化細胞分化プロトコールに従って分化させる。その過程におけるGFP発色のタイミングや強度を検討する。分化した表皮角化細胞について形態や遺伝子発現パターン、刺激に対する反応性などについて比較検討する。さらに三次元培養皮膚モデルを作製し、表皮角化細胞としての機能についても検討を行う。最終的には免疫不全マウスに三次元培養皮膚を移植し、局所における皮膚反応についても検討したい
さらに、フィラグリン遺伝子変異のあるアトピー性皮膚炎患者由来のiPS細胞を作製し、これについても同様のプロトコールにより表皮角化細胞に分化させ、さらに三次元培養皮膚を作製して人為的な変異をいれた場合との違いについて比較検討を行うことも視野に入れる。
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