2015 Fiscal Year Research-status Report
パネル遺伝子解析による新規プロテアソーム機能不全症の同定と病態解明
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15K09780
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
金澤 伸雄 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (90343227)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲葉 豊 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00647571)
国本 佳代 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (10438278)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / 蛋白質 / 免疫学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NNSが疑われ臨床診断基準5項目を満たす横浜の小児例、福島の成人例と、脂肪萎縮がなく診断基準を満たさないが臨床的に酷似する沖縄の幼児例について、PSMB8遺伝子解析にて変異を認めないため、プロテアソーム関連パネル遺伝子解析と、両親（福島の症例は父親のみ）とトリオでのエキソーム解析を行った。その結果、横浜の小児例では有意な変異を見いだせなかったが、福島の成人例ではプロテアソーム合成シャペロンの一つであるADRM1遺伝子に新規ヘテロ変異を見出した。末梢血単核球のプロテアソーム活性測定にてキモトリプシン活性の軽度低下を認めたが、エキソーム解析により円板状エリテマトーデスと診断されていた父親とともに既知のTREX1遺伝子ヘテロ変異を認め、優性遺伝型のエカルディ・グティエール症候群（家族性凍瘡様ループス）と診断した。ADRM1変異は患者特異的であり、父子の表現型の違いを反映する可能性が考えられた。また沖縄の幼児例では、プロテアソーム誘導型β1iサブユニットコードするPSMB9遺伝子の新規ヘテロ変異と合成シャペロンの一つであるPSMD9遺伝子のまれな一塩基多型（SNP）を認めた。末梢血単核球のプロテアソーム活性測定では明らかな異常を認めなかったが、エキソーム解析にてその他に有意な変異を見いだせず、またPSMB9変異は患児特異的、PSMD9変異は患児と父親に認めることから、PSMB9変異が主たる原因と考えられた。プロテアソーム活性測定の精度を上げるため、細胞蛋白質をシュクロース濃度勾配にて分画したものを用いた測定も行ったが、すべての分画に共通した明らかな機能低下・亢進は認められなかった。その他にも、臨床診断基準5項目を満たしNNSが疑われる症例が複数見出されており、うち1例においてはPSMB8変異を認めておらず、さらなる検討を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請時の、＜NNS臨床診断例におけるパネルあるいはエキソーム解析によるプロテアソーム関連遺伝子変異の同定＞を開始し、同時に＜NNS臨床診断例におけるプロテアソーム酵素活性の測定＞するという本年度の研究計画をほぼ遂行した。具体的には、当科に遺伝性自己炎症疾患疑いとして相談のあった症例のうち、臨床的にNNSと診断されるがPSMB8変異を認めない3症例に対し、インフォームドコンセントを得て検体を長崎大学に送付し、次世代シーケンサーを用いたプロテアソーム関連遺伝子のパネル解析と全エキソーム解析を行った。当科においては、サンガー法のダイレクトシーケンスによりPSMB8など候補遺伝子の解析による既存遺伝性自己炎症疾患の除外を行った。さらに、プロテアソーム関連遺伝子に変異を認めた2症例について、市販のキットを用いて患者末梢血単核球、不死化B細胞などのプロテアソーム酵素活性を測定し、NNS患者や健常者由来細胞と比較した。その結果、1症例では有意な変異を認めず、1症例はADRM1の新生新規ヘテロ変異を見出したもののTREX1の疾患関連変異を認めエカルディ・グティエール症候群と診断したが、残る1症例にPSMB9の新生新規ヘテロ変異とPSMD9の稀なSNPを見出した。市販のキットを用いたプロテアソーム酵素活性測定では異常を認めていないが、PSMB8以外の遺伝子変異によるプロテアソーム関連自己炎症疾患の可能性があり、今後もさらなる検討を予定している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は平成27年度に引き続き、＜NNS臨床診断例におけるパネルあるいはエキソーム解析によるプロテアソーム関連遺伝子変異の同定＞と＜NNS臨床診断例におけるプロテアソーム酵素活性の測定＞を進め、PSMB8以外の遺伝子変異によるNNSを探索するとともに、プロテアソーム関連遺伝子変異が見出された症例について、＜NNS臨床診断例におけるユビキチン蓄積の検討＞と＜NNS臨床診断例における血清中サイトカインの網羅的解析＞を行う。具体的には、患者末梢血単核球、不死化B細胞などから細胞質蛋白質を抽出してSDS-PAGEに流し、抗ユビキチン抗体でウェスタンブロットを行い、NNS患者や健常者由来細胞と比較する。また、皮疹などの組織標本の薄切切片を抗ユビキチン抗体にて免疫染色し、CD68などと二重染色して蓄積細胞を同定する。また、患者血清中の炎症性サイトカイン・ケモカイン濃度を網羅的に測定し、NNS患者や健常者由来細胞と比較する。特にIP-10とIL-6について、計時的変化とともに検討する。同時に、＜NNS患者におけるパネル解析によるプロテアソーム関連遺伝子変異の検索＞として、これまでにPSMB8変異が見出されているNNS患者についてプロテアソーム関連遺伝子をパネルで網羅的に検討することにより、皆同じ変異をホモで持っていながらその進行度や重症度には幅がある理由を検討する。
さらに平成29年度は、平成28年度までの成果を受け、＜広義のNNSにおけるプロテアソーム機能是正の試み＞として、パネルあるいはエキソーム解析によってプロテアソーム関連遺伝子変異が認められた検体に共通に見られるプロテアソーム機能不全そのものを対象に、その是正法を検討する。すなわち、細胞レベルでの①正常プロテアソーム複合体補充療法、②変異サブユニット発現阻害療法、③正常サブユニット遺伝子導入療法の可否を検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究計画をほぼ遂行したうえで約5万円分使い切れずに残ったが、無理に端数を使い切らずに繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越額は大きなものではなく、消耗品（試薬など）費に約5万円分追加となるのみで、使用予定の大枠に変更はない。
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