Establishment of Gene and Cell Therapy for Epidermolysis Bullosa using iPSC technology

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K09789
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 伊藤 宗成 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (20408371)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 遺伝子治療 / 先天性表皮水疱症

Outline of Annual Research Achievements

当初の平成29年度の到達目標は、分化誘導したiPSC由来細胞のin vivoでの機能解析であったが、一昨年度までに到達予定であった「遺伝子相同組み換えを利用した、患者由来iPSC内での遺伝子変異の修復（遺伝子治療）」が終了しておらず、まずはそちらの達成が第一の目標となった。
一昨年度に、遺伝子変異のために作製していた鋳型DNAに問題が生じたため（遺伝子改変後のiPSCから薬剤耐性遺伝子の除去を試みたができなかった）、新たな鋳型DNAを作製した。新たな鋳型DNAは、もうひとつの遺伝子変異をターゲットとし、さらに薬剤耐性遺伝子が抜けた時にnegative selectionができるよう、HSV-TK遺伝子も組み込むなどの工夫を凝らした。
その後、新たな鋳型DNAとCRISPR発現vectorをElectroporationにて患者由来iPSCに導入し、薬剤耐性による選別および遺伝子配列の解析を経て、遺伝子変異の修復がなされている可能性があるiPSCを複数取得した。その後、遺伝子変異の修復が正しい位置で行われていることを確認するため、Southern blottingによる解析を試みたが、条件設定がうまくいかず大変苦慮した。原因探索のため、複数のBlotting条件やDNAの抽出方法を試したところ、DNAの抽出方法により不具合が生じることが確認でき、最終的には解析を進めることができたが、この条件設定に非常に多くの時間を費やした。取得された遺伝子変異修復iPSCは、ガンシクロビル添加下にて生存できず、HSV-TK遺伝子も正常に機能していることも確認された。
現在、遺伝子変異修復iPSCの細胞内でTransposaseを発現させ、薬剤耐性遺伝子（neoおよびHSV－TK遺伝子）の除去を試みている。また同時にiPSCからの表皮細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞への分化誘導も並行して進めている。