ヒト有棘細胞癌関連遺伝子変異の解析－ヒストン脱メチル化酵素欠損マウスを用いた探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09791
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 藤原 恭子 日本大学, 医学部, 助教 (40595708)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 照井 正 日本大学, 医学部, 教授 (30172109)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 有棘細胞癌 / マウスモデル / 腫瘍関連遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までの解析により絞り込んだ、新規ヒト有棘細胞癌関連遺伝子候補A, Bについて、本年度はその機能解析を行った。SCC細胞株A431 および不死化ケラチノサイト細胞株HaCaTにおける遺伝子Aの発現をsiRNAにより抑制し、細胞増殖能、遊走能、浸潤能をWST8アッセイ、Wound healing assay、Matrigel invasion assay によりそれぞれ検討した。
また細胞のストレス応答性への影響を調べるために、DNA損傷剤や過酸化水素水の投与、放射線照射を行い、遺伝子Aの発現抑制により、細胞死の誘導レベルに変化が見られるかどうか、WST8アッセイにより検討した。以上の解析において、いずれの細胞株においても細胞増殖能、浸潤能、およびストレス応答性は遺伝子Aの発現抑制により変化しなかった。また、遊走能についても明確な差は見られなかったが、HaCaT細胞において、TGFβ1投与により細胞の遊走能を亢進させた状態では、遺伝子Aの発現抑制による遊走能の阻害が見られた。このことから遺伝子AはTGFβ1のシグナル伝達系に作用し上皮間葉系転換の誘導に影響を与える可能性が考えられたため、EMT 関連のマーカーの変異を調べたが、現時点では遺伝子Aの抑制に伴い発現が変化する遺伝子は見つかっていない。また遺伝子Aを過剰発現した場合は、特に明確なフェノタイプの変化は観察されなかった。遺伝子BについてもA431およびHaCaTにおける発現をsiRNAを用いて抑制し、遺伝子Aと同様の手法で解析を行った。その結果、遺伝子Bの発現抑制により、いずれの細胞においても細胞の生存率が明確に低下することが観察された。過剰発現系の実験が上手くいっていないため、現在、ベクターの再作成を含めた再実験を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、前年度に絞り込んだ新規腫瘍関連遺伝子の候補A, Bについて機能解析を行うことを目標に研究を進め、遺伝子Aについては予定通り機能解析を行ったが、遺伝子Bについては過剰発現系の解析が進んでいないため、進捗がやや遅れていると評価した。また遺伝子Aについては、TGFβ1のシグナル伝達系に干渉し、細胞の遊走能を変化させているとのデータが得られたが、現時点ではまだ具体的にどのようなメカニズムによりTGFβ１のシグナル伝達系に影響を与えているか解明できていないため、これも最終年度の課題として残されている。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子Aについては、どのような作用機序によりTGFβ１シグナル伝達系に干渉し細胞遊走能に影響を与えているか、詳細な解明を行う。具体的には、1) 遺伝子AがTGFβ１の発現レベルや安定性に作用するかどうか、2) 本年度調べたもの以外のTGFβ１の下流遺伝子について、遺伝子Aの発現抑制により変化するかどうか、3）TGFβ１が遺伝子Aの発現誘導や抑制を行う機能を持つかどうか、といったことについて検討を行う。遺伝子Bについては、遺伝子Bの発現抑制により細胞の生存率が低下する具体的な作用機序について検討するとともに、過剰発現系についてもベクターが作成でき次第、順次実験を進めていく。