ゲノム編集技術を用いた新規前頭側頭葉変性症モデルマウスの開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09850
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 細川 雅人 公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 主席研究員 (00435116)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: TDP-43 / C9orf72 / Tau / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 病態モデル

Outline of Annual Research Achievements

(1) TDP-43ノックインマウスの作製
ヒトとマウスでアミノ酸配列が大きく異なるTDP-43遺伝子のエクソン5, 6部分を、ゲノム編集によりヒト型に置換したTDP-43ノックインマウスの作製をおこなった。マウスTDP-43のイントロン5を切断するためのsingle-guide RNA (sgRNA)、二本鎖DNA切断酵素Cas9のmRNA、相同組換え用ヒトTDP-43のエクソン5, 6を含んだドナーDNAをマウス受精卵に導入した。産まれた個体の中から、相同組換えによってヒト型TDP-43が挿入されたマウス3系統を樹立した。繁殖後ヒト型TDP-43の発現を確認する予定である。
(2) C9ORF72ノックインマウスの作製
マウスC9ORF72のエクソン1の上流にGGGGCCリピート部分に相当する場所があり、この部位へゲノム編集技術を利用し、GGGGCCが145回繰り返された(GGGGCC)145の挿入をおこなった。C9ORF72を標的としたsgRNA、二本鎖DNA切断酵素Cas9のmRNA、相同組換えに用いる(GGGGCC)x145配列を含んだドナーDNAの3つをマウス受精卵の雄性前核に注入後、偽妊娠マウスの子宮内へ受精卵を戻した。産まれた個体の中から、相同組換えによって(GGGGCC)x145が挿入されたマウスを選択し、繁殖後実験に用いる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

TDP-43ノックインマウス、C9orf72ノックインマウスともにsgRNAの作製、ドナーDNAの作製、および受精卵へのインジェクションが計画通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

当初ワイルドタイプのCas9をゲノム編集に使用していたが、2016年1月にCas9に変異を入れ、off-target効果を減少できるCas9-HF1が開発された。今後の受精卵へのインジェクションにはCas9-HF1を使用し、予期しない部位への遺伝子変異が導入されていない個体作製を目指す予定である。

Causes of Carryover

購入した実験動物麻酔装置が計画より安価であったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額はAlzheimer Association International Conferenceにおける研究成果発表および共同研究の際の旅費に充当する計画である。

Research Products

• [Journal Article] The Abundance of Nonphosphorylated Tau in Mouse and Human Tauopathy Brains Revealed by the Use of Phos-Tag Method (2016)
  • Author(s): Kimura T, Hatsuta H, Masuda-Suzukake M, Hosokawa M, Ishiguro K, Akiyama H, Murayama S, Hasegawa M, Hisanaga S
  • Journal Title: American Journal of Pathology Volume: 186 Pages: 398-409
  • DOI: doi: 10.1016/j.ajpath.2015.10.009.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chorea as a clinical feature of the basophilic inclusion body disease subtype of fused-in-sarcoma-associated frontotemporal lobar degeneration (2016)
  • Author(s): Kawakami I, Kobayashi Z, Arai T, Yokota O, Nonaka T, Aoki N, Niizato K, Oshima K, HigashiS, Katsuse O, Hosokawa M, Hasegawa M, Akiyama H
  • Journal Title: Acta Neuropathologica Communication Volume: 4 Pages: 36
  • DOI: doi: 10.1186/s40478-016-0304-9.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An autopsied case of corticobasal degeneration showing severe cerebral atrophy over a protracted disease course of 16 years (2015)
  • Author(s): Kondo D, Hino H, Shibuya K, Fujisawa K, Kosaka K, Hirayasu Y, Yamamoto R, Kasanuki K, Minegishi M, Sato K, Hosokawa M, Arai T, Arai H, Iseki E
  • Journal Title: Neuropathology Volume: 35 Pages: 280-288
  • DOI: doi: 10.1111/neup.12188.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] グラニュリン変異例における神経変性疾患関連タンパクの重複蓄積 (2015)
  • Author(s): 細川雅人、新井哲明、近藤ひろみ、長谷川成人、秋山治彦
  • Organizer: 異常タンパク伝播仮説に基づく神経疾患の画期的治療法の開発 平成27年度 成果報告会
  • Place of Presentation: 東京都医学総合研究所（東京都・世田谷区）
  • Year and Date: 2015-12-17 – 2015-12-17
• [Presentation] プログラニュリン変異脳における神経変性疾患関連タンパク質の重複蓄積 (2015)
  • Author(s): 細川雅人、新井哲明、近藤ひろみ、長谷川成人、秋山治彦
  • Organizer: 第34回 日本認知症学会
  • Place of Presentation: リンクステーションホール青森（青森県・青森市）
  • Year and Date: 2015-10-02 – 2015-10-02
• [Presentation] The abundance of nonphosphorylated tau among heterogeneously phosphorylated tau species in vivo in mice and human brains (2015)
  • Author(s): 木村妙子、初田裕幸、鈴掛－増田雅美、細川雅人、石黒幸一、秋山治彦、村山繁雄、長谷川成人、久永眞市
  • Organizer: 第58回 日本神経化学会大会
  • Place of Presentation: 大宮ソニックシティ（埼玉県・さいたま市）
  • Year and Date: 2015-09-13 – 2015-09-13
• [Remarks] 公益財団法人東京都医学総合研究所
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/
• [Remarks] 平成27年度日本認知症学会 学会奨励賞（基礎研究部門）を受賞
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2015/1003.html