生体内被ばく細胞追跡システムの開発研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10013
• Research Institution: National Institute of Radiological Sciences
• Principal Investigator: 須藤 仁美 国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 分子イメージング研究センター, 研究員 (10415416)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 放射線応答遺伝子 / ルシフェラーゼアッセイ

Outline of Annual Research Achievements

これまでの放射線の生体影響研究では、放射線は数多く存在する細胞に対して『均一に照射されたと仮定』して解析されている場合が多かった。しかしながら、実際には照射は不均一であり、被ばくした細胞としていない細胞が存在する。また、放射線発がんは必ずしも被ばくを受けた細胞から生ずるのではないことが判明しつつある。放射性発がん、特に内部被ばくによる発がんを理解するには、被ばくした個々の細胞がどのような運命を辿り、また被ばくしなかった細胞との関係性について長期間に渡り追跡することが必要である。これには、細胞の被ばくの有無を可視化できる「生体内被ばく細胞追跡システム」を構築する必要がある。そこで本研究では、放射線に鋭敏かつ特異的に応答する遺伝子プロモーターを見いだし、そのプロモーターによってCre遺伝子を発現させ、LoxP配列を持つレポーター遺伝子の発現を変化させることにより、個々の細胞における被ばくの有無を可視化する「生体内被ばく細胞追跡システム」を構築することを目的とする。
平成２７年度は、被ばく細胞の追跡に最も適した遺伝子プロモーターの選択を行った。文献的に既知の遺伝子プロモーターに加え、以前に申請者らが行った大規模発現解析から同定した放射線応答性遺伝子のプロモーターを単離し、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を持つベクターをそれぞれ作製する。作製したベクターを細胞に導入し、放射線照射後にルシフェラーゼアッセイを行い、放射線被ばくに対して優れた応答性と特異性を持つ遺伝子プロモーターを選択する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

放射線に鋭敏かつ特異的に応答する遺伝子プロモーターのスクリーニングを行った。文献検索からの候補（c-Fos、c-Jun、AP-1、NFκBなど）のほか、以前に行った大規模発現解析から独自に見いだしている遺伝子のプロモーターとあわせて30個の遺伝子に対して、スクリーニングを行うために、各遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼレポーターベクターであるpGL4の上流に挿入したコンストラクトの作製を試みた。しかし、コンストラクトの構築に時間を要しており、スクリーニングが終了していない。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、放射線応答遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼレポーターベクターの上流に挿入したコンストラクトの作製を行うとともに、作製したコンストラクトを細胞に導入し、放射線照射後にルシフェラーゼアッセイを行い、放射線被ばくに対して優れた応答性をもつ遺伝子プロモーターの選択を行う。また、選択した遺伝子プロモーターを用いて、Cre/loxP発現制御システムを構築する。

Causes of Carryover

放射線に鋭敏に応答する遺伝子プロモーターのスクリーニングを行うための、候補遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼレポーターベクターの上流に挿入したコンストラクトの構築に時間を要しており、スクリーニンングが終了していないため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

放射線応答性が高いプロモーター領域をスクリーニングするための、クローニング関連とレポーターアッセイ関連、および細胞培養関連費用に多くを使用する予定である。備品や設備については、既存のものを使用する。