2016 Fiscal Year Research-status Report

生体内被ばく細胞追跡システムの開発研究

Research Project

Project/Area Number	15K10013
Research Institution	National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology
Principal Investigator	須藤仁美国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所分子イメージング診断治療研究部, 研究員(任常) (10415416)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	放射線応答遺伝子 / Cre/loxPシステム
Outline of Annual Research Achievements	これまでの放射線の生体影響研究では、放射線は数多く存在する細胞に対して『均一に照射されたと仮定』して解析されている場合が多かった。しかしながら、実際には照射は不均一であり、被ばくした細胞としていない細胞が存在する。放射線発がんは必ずしも被ばくを受けた細胞から生ずるのではないことが判明しつつある。放射性発がん、特に内部被ばくによる発がんを理解するには、被ばくした個々の細胞がどのような運命を辿り、また被ばくしなかった細胞との関係性について長期間に渡り追跡することが必要である。これには、細胞の被ばくの有無を可視化できる「生体内被ばく細胞追跡システム」を構築する必要がある。そこで本研究では、放射線に鋭敏かつ特異的に応答する遺伝子プロモーターを見いだし、そのプロモーターによってCre遺伝子を発現させ、LoxP配列を持つレポーター遺伝子の発現を変化させることにより、個々の細胞における被ばくの有無を可視化する「生体内被ばく細胞追跡システム」を構築ことを目的とする。平成２８年度は、前年度に引き続き、高い放射線応答性をもつ遺伝子数種類について、その下流にルシフェラーゼ遺伝子をもつベクターを作製した。作製したベクターを細胞に導入し、放射線照射後にルシフェラーゼアッセイを行い、放射線に対して優れた応答性を持つ遺伝子のスクリーニングを行った。同時に、Cre/LoxPシステムによる「被ばく細胞追跡システム」を構築するため、優れた放射線応答性をもつことがわかっているEGR1を用いて、放射線照射後にCreリコンビナーゼを発現するベクターの構築、およびCMV-loxP-DsRed-ZsGreenベクターの構築を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度、高い放射線応答性をもつ30個程度の遺伝子について、その下流にルシフェラーゼ遺伝子をもつベクターの作製が遅れていたため、放射線に鋭敏かつ特異的に応答する遺伝子プロモーターのスクリーニングが進まなかった。平成28年度も、引き続きベクターの作製を行った。この際、DNAシーケンサーに不具合が生じ、数ヶ月使用できなかったため、ベクターの構築に時間がかかってしまった。その後、作製したベクターを細胞に導入し、放射線照射後にルシフェラーゼアッセイを行い、放射線に対して優れた応答性を持つ遺伝子のスクリーニングを行ったが、前年度の遅れを完全に取り戻すまでには至っていない。また、放射線に鋭敏に応答する遺伝子プロモーターの選択はできたが、選択した遺伝子プロモーターが放射線特異的に応答するかの検討は出来ていない。
Strategy for Future Research Activity	スクリーニングを行うとともに、Cre/LoxPシステムによる「被ばく細胞追跡システム」を構築するため、以前にルシフェラーゼアッセイにて、優れた放射線応答性をもつことがわかっているEGR1を用いて、放射線照射後にCreリコンビナーゼを発現するベクターの構築と、CMV-loxP-DsRed-ZsGreenベクターの構築を行い、このシステムが放射線に応答してワークすることを確認する。スクリーニングにより選択された遺伝子プロモーターを随時このシステムに応用していく。放射線に鋭敏に応答する遺伝子プロモーターを用いたCre/loxPシステムの構築を優先的に行い、各遺伝子プロモーターの放射線特異性の検討の優先順位を下げる。
Causes of Carryover	前年度に引き続き、放射線に鋭敏かつ特異的に応答する遺伝子プロモーターの選択を行っていたが、DNAシーケンサーに不具合が生じ、数ヶ月間使用できなかった。そのため、DNAシーケンサーに使用する分の研究費が使い切れなかった。また、研究が遅れているために、学会等での成果発表が出来なかったため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	DNA配列の確認などは、外部に委託する予定である。ルシフェラーゼアッセイにて選択した遺伝子プロモーターをCre/loxPシステムに組み込む為の、クローニング関連、および細胞培養関連に費用を使用する予定である。また学会での研究成果発表や、論文作製・投稿にも費用を使用する予定である。