ヒトiPS細胞由来バイオ人工肝臓のin vivo performanceの検討

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10023
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 白水 泰昌 京都大学, 再生医科学研究所, 非常勤講師 (20279186)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 角 昭一郎 京都大学, 再生医科学研究所, 准教授 (80252906)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヒトiPS細胞 / バイオ人工肝 / 内胚葉

Outline of Annual Research Achievements

ヒトiPS細胞をfeeder細胞freeとして安定した未分化維持培養を行うことができ、以下の分化誘導過程へと進むことが可能となった。元来definitive endodermへの分化誘導に際し、Activin A treatmentが広く応用されている。我々はfeeder freeヒトiPS細胞を無血清培地下にActivin A treatmentを行うと同時に分子阻害剤を加えることで、Activin A単独のtreatmentに比べてより効果的なdefinitive endodermへの誘導が可能であった。この過程は、Foxa2・Sox17といったdefinitive endoderm特異的な遺伝子発現をRT-PCR、タンパク発現を細胞免疫染色法によって確認し評価した。また誘導されたdefinitive endodermを引き続き肝前駆細胞へと分化誘導を行うに際し、後のバイオ人工肝の作成を踏まえて、付着培養だけでなく浮遊培養でもサイトカインtreatmentを行い、肝前駆細胞の誘導を確認した。この段階はAFP・ALB・HNF4aの遺伝子発現をRT-PCR法によって確認した。浮遊培養にて細胞塊を作成するに先立ちdefinitive endoderm細胞を酵素処理して剥離させ単細胞浮遊液を作成した。この細胞浮遊液にROCK inhibitorを加えることで、死細胞が劇的に減少し良好な細胞塊形成が可能となった。バイオ人工肝の作製に先立ち、分化誘導前のヒトiPS細胞を、polyvinyl alcohol (PVA)ゲルに包埋した。保存液をPVAに混和するより、細胞培地をPVAに混和した方が、凍結解凍後のヒトiPS細胞の生存はより維持されることが示唆された。この過程はPVAに包埋した状態のままのヒトiPS細胞をカルセイン染色にて観察し、細胞の生死を確認し評価した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ヒトiPS細胞をPVAゲルに包埋し、凍結後再解凍しrecoveryを評価したところ、思いのほかrecoveryが不良であったため、現在ROCK inhibitorを併用して細胞のrecoveryの改善につとめているところである。

Strategy for Future Research Activity

すでに成功しているヒトiPS細胞から誘導した肝前駆細胞を、現在作製工夫中のPVAゲルに包埋しバイオ人工肝を作製する。当研究室で実績のあるラット膵島細胞からバイオ人工膵の作製プロトコールに基づきヒトiPS細胞で同様に細胞包埋を行うとrecoveryが著しく不良であるため、現在ROCK inhibitorを用いてバイオ人工肝の作製プロトコールを新たに構築中である。