2015 Fiscal Year Research-status Report
穿刺吸引細胞診検体のトランスクリプトーム解析による甲状腺癌術前診断の可能性を探る
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15K10063
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
軸薗 智雄 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 客員研究員 (10465312)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉谷 巌 日本医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50465936)
石橋 宰 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (70293214)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マイクロRNA / 細胞診 / 甲状腺濾胞癌 / 液状余剰検体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞診検査においては、一般的に病変部より採取した細胞を直接スライドグラスに塗抹して標本とするが、細胞の採取や塗抹の手技によって標本の質に差が生じ、それが診断結果に影響を及ぼしうるという問題がある。一方、採取した細胞を固定溶液中に回収して用いる液状化検体細胞診（Liquid based cytology; LBC）では、従来法に比して標本の均質化が可能であり、普及が進んでいる。しかし、採取された細胞の純度や回収効率が安定しないことや、固定された細胞からのRNA抽出に困難を伴うことから、遺伝子発現を指標とした診断への応用は進んでいない。そこで本研究では、LBC検体のマイクロRNA解析による甲状腺癌術前診断技術開発の予備実験として、甲状腺癌細胞検体からの細胞回収時にガラス繊維フィルターを用いたトラップ法を採用することにより回収効率の改善を試みた。その結果、フィルターを用いることにより検体中のほぼすべての細胞を回収することが可能であった。また、このことに伴い、RNA収量が増加した。次に、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルからのRNA抽出において有効であるProtenase K（ProK）処理が、液状化検体細胞診（Liquid based cytology; LBC）検体に対してRNA抽出効率に及ぼす効果について検討した。その結果、LBC検体からのRNA抽出にはProK処理が必須であることが示唆された。さらに、実際の臨床サンプルである穿刺吸引細胞診の余剰検体からRNAを抽出し、ProK処理をした群で解析が可能かどうかを検証したところ、ProK処理した群においてU6 small nuclear RNA （U6）やmiR-221の発現を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①ガラス繊維フィルターを用いることによる検体中の細胞回収効率の評価
【方法】ヒト甲状腺乳頭癌細胞株K-1を培養し、一定数の細胞を固定保存液サイトリッチレッド（ベクトンディッキンソン）中に懸濁した。これを４℃にて一晩静置し、ガラス繊維フィルターGF/C（GEヘルスケア）に通すことにより細胞をトラップした。フィルターをPBSにて洗浄した後、ProteinaseK（ProK）を含む溶解液中に浸漬し、55℃にて0～3時間インキュベートした。この液を回収後RNAiso-Blood（タカラバイオ）を用いてRNAを抽出した。【結果】フィルターを用いることにより、検体中のほぼすべての細胞を回収することが可能であった。
②ProK処理がLBC検体の細胞からのRNA抽出に及ぼす効果についての検討
【方法】ヒト甲状腺乳頭癌細胞株K-1を培養し、一定数の細胞を固定しない群（A群）と固定保存液サイトリッチレッドにて固定した群（B群）に分けた。各群のフィルターを、ProKを含む溶解液中に0時間（B-0群）、3時間（B-3群）、および6時間（B-6群）浸漬した。【結果】A群とB-3群およびB-6群からRNA抽出は良好であった。また、定量的RT-PCRにより、U6を検出することができた。以上より、LBC検体からのRNA抽出にはProK処理が必須であることが示唆された。
③抽出したRNAの品質評価。
【方法】甲状腺乳頭癌と病理診断された患者5例のサンプルを使用した。穿刺した針はスライドガラスに吹き付けた後に、針に残った余剰検体をサイトリッチレッド保存液に入れて保存、この保存液を用いたサンプルからRNA 抽出を行った。この際、ProK処理した群としない群とでRNA抽出の比較を行った。【結果】ProK処理した群においてのみ、U6やmiR-221の発現を確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①定量的PCRに基づくmiRNA アレイ解析とデータの臨床統計解析
臨床検体を、病理診断および癌死危険度分類によって高危険度群と低危険度群に分類し、2 群間での発
現が有意に変動しているマイクロRNA（miRNA）の同定を試みる。具体的には、TaqMan Human MicroRNA Array（ライフテクノロジーズ）を用いて、2群において網羅的かつ定量的なmiRNA 発現プロファイルの比較解析を行う。本解析の結果、2群間で統計的有意差のあるmiRNA を診断マーカーの候補とする。次に、これらの候補miRNA について、検体ごとにその発現量をリアルタイムPCR にて定量解析し、アレイの結果を検証するとともに、ロジスティック解析を行う。これらの解析において条件を満たしたmiRNAを、最終的に術前の細胞診の段階で癌の悪性度を診断することの出来るバイオマーカーの候補とする。
② 次世代シーケンシングによる網羅的トランスクリプトーム解析（RNA-seq）
RNA-seq 解析のためのcDNA の作製に供するため、上記のRNA についてバイオアナライザー（アジレント）により純度と分解の程度の確認を行う。その後、Ribo-zero Gold Kit（イルミナ）を用いてribosomal RNA の除去とcDNA の合成を行う。作製したcDNA は、次世代シーケンサーHiSeq2500（イルミナ）を用いた両端塩基配列解析（pair-end RNA-seq）に供する。得られたデータのバイオインフォマティクス解析を行い、上記2群間で発現が有意に異なるトランスクリプトを選別した後、定量的RT-PCR による発現変動の検証を行う。また、発現変動トランスクリプトが蛋白質コード遺伝子由来であった場合は、当該蛋白質の発現変動についてウェスタンブロット解析により検証する。
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| Causes of Carryover |
液状細胞診検体からの細胞回収法を遠沈法からガラス繊維フィルタートラップ法に変更したことにより、1回の実験当たりの回収細胞数が増加した。その結果、RNA抽出試薬の消費が予定よりも抑えられたことが、上記残額が生じた主たる理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、当該年度の残額と合わせ、当初の計画よりも検体の数を若干増やし解析を行う予定である。
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