2015 Fiscal Year Research-status Report
樹状細胞サブセットに着目した新規癌ワクチン療法の開発
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15K10146
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
松田 健司 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (30398458)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
瀧藤 克也 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (00254540)
山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190)
堀田 司 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (50244744)
勝田 将裕 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (50464673)
横山 省三 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (90398462)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 樹状細胞サブセット |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗原提示細胞である樹状細胞は、機能的特性のことなる複数のサブセットから構成されている。その中でも、CD8α陽性樹状細胞が、抗腫瘍・抗ウイルス免疫応答において、重要な働きをしていることが明らかになっている。そのCD8α陽性樹状細胞に特異的に発現する分子として、ケモカイン受容体XCR1が見いだされた。さらに、XCR1のリガンドは、ケモカインXCL1であるが、抗原によるT細胞の活性化のために、CD8a陽性樹状細胞におけるXCL1/XCR1システムが重要であることも報告されている。本研究では、抗原特異的ペプチド・XCL1融合タンパク質を用いることにより、選択的に“真の樹状細胞”と考えられるCD8a陽性樹状細胞（XCR1陽性）に抗原特異的ペプチドを送達させ、非選択的に抗原を免疫する従来のシステムよりも、より強い免疫応答を活性化相で惹起させる方法を確立することを目的としている。本年度は、様々な抗原ペプチドをマウスXCL1に融合させた融合タンパク質の作成を試みた。XCL1とAH-1由来ペプチドとの融合タンパク質や、マウス実験にて仮想抗原としてよく用いられるトリOvalbumin由来ペプチドとの融合タンパク質の作成を進め、発現ベクターの構築、融合タンパク質の発現系の樹立と精製法の確立を検討し、融合タンパク質を作成した。これらは、CD8 T細胞（細胞傷害性T細胞）をはじめとする免疫応答を検討する際に、実験系によりこれら融合タンパク質を使い分けができると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
XCL1と腫瘍抗原（AH-1とOVAペプチド）との融合タンパク質の作成・精製法を確立した。具体的には、マウスXCL1 cDNAの下流に、腫瘍抗原ペプチドをコードする配列を挿入し、さらに精製用のTagを挿入した発現ベクターを作成した。これを培養細胞株に導入し、培養上清中に産生される融合タンパク質の産生量をtagに対するwestern blottingにて検討した。その際、複数の発現ベクターを用いて、また、複数の培養細胞株（293T細胞およびCHO細胞）を用いて最適な条件を検討した。最終的には、1回の精製で、必要最低量の融合タンパク質を得ることができるようになった。しかし、まだまだ、得られる量が十分とは言えず、産生量の増加・精製法の工夫を行っていく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
十分量の融合タンパク質が得られれば、それを蛍光物質などで標識し、まずin vitroにて融合タンパク質がXCR1陽性樹状細胞に送達されるか検討する。具体的には、マウス骨髄よりFlt3Lにて樹状細胞を誘導し、これに蛍光物質などで標識した融合タンパク質を加えて培養し、XCR1陽性樹状細胞で融合タンパク質由来の蛍光が検出されるかflowcytometroyを用いて解析する。これが確認されれば、続いて、in vivoにて融合タンパク質の送達を確認する。具体的には、マウス皮下に融合タンパク質を投与し、所属リンパ節や脾臓中のCD8a陽性樹状細胞で融合タンパク質由来の蛍光が検出されるか、flowcytometoryや免疫染色にて確認する。その際、融合タンパク質の投与量やtime courseを検討する。融合タンパク質の送達が確認されれば、融合タンパク質を単独で、あるいはアジュバントと共に免疫し、脾細胞や所属リンパ節中の抗原特異的CD8 T細胞（CTL）をtetramer染色や抗原特的なIFNg産生にて検討する。抗原特異的CTLの活性化が確認されれば、マウスに腫瘍を接種し、融合タンパク質を免疫することで腫瘍増殖が抑制されるかどうか、また、腫瘍存在下でのCD8+樹状細胞やCTLの活性化を検討する。さらに、腫瘍局所での樹状細胞やCTLの活性化を、腫瘍浸潤リンパ球や腫瘍浸潤樹状細胞を腫瘍より分離して検討する（flowcytometoryやELISA等)。この際に、樹状細胞やT細胞の活性化マーカーの他、CTLA4などのimmune checkpoint分子の発現も時間経過を追って検討する。Immune checkpoint分子の発現が強く誘導されているのであれば、高く発現が誘導されるタイミングにて、抗immune checkpoint薬を投与することで、さらに強い抗腫瘍効果が得られるか検討する。
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