2016 Fiscal Year Research-status Report

次世代シークエンサーを用いた統合解析による大腸癌肝転移に関するゲノム解析

Research Project

Project/Area Number	15K10152
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	緑川泰日本大学, 医学部, 准教授 (10292905)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	大腸がん肝転移 / 発現解析 / エピゲノム / 統合解析
Outline of Annual Research Achievements	前年度で行った、大腸がん肝転移患者の大腸粘膜、原発巣、肝転移巣（32例）についてのエクソームシーケンスおよびRNAシーケンスのデータを統合解析した。この二種類のシーケンスのデータにより突然変異を有する遺伝子、発現が変化している遺伝子の同定を行い、また融合遺伝子を検出することにより大腸癌の発がんから血行性転移まで、多段階発がんのステップを観察することが可能であった。さらにエピゲノム解析として450Kメチル化アレイによりプロモータ領域のメチル化による2-way clusteringにより、大腸がんサンプルが低メチル、中メチル、高メチル化の3クラスに分類されることがわかり、これらのクラスターが生命予後に強く影響を与えていることを明らかにした。この3群のクラスターについてエクソームシーケンスによる解析結果を統合すると、KRAS, APC, BRAFの遺伝子変異が強く相関してることがわかり、RNAシーケンスによる包括的遺伝子発現解析により大腸がん発がんから肝転移へと進展してゆく過程で出現するサブクラスターを同定し得た。今年度に得られた大腸がん多段階発癌における責任遺伝子について、大腸がん細胞株を用いたin vitroの実験系で機能解析を行い、今回シーケンスデータより推測される大腸がん発がんメカニズムの証明を残り1年間で行って行く予定である。また、現在得られているデータのみでも、これまで報告されていなかった知見が得られており、随時学会や論文を通じて国内外で報告してゆく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason この2年間で予定していたエクソームシーケンス、RNAシーケンス、450Kメチル化アレイを含む次世代シーケンサーによる解析が一通り終了し、サンプル数についてもおおむね目標数の腫瘍についてを解析し得た。さらにバイオインフォマティクスによる解析も順調の行い得て、責任遺伝子の同定のみならず、発現データやメチル化データによるクラスタリングがドライバー遺伝子の変異、患者の生命予後と有意に相関するポジティブデータを導き出すことができた。以上のデータについてはいずれも大腸がん領域では新しい知見であり、サンプルの収集に加えて患者の臨床データや生命予後、病理データを匿名化連結可能な状態で参照し、異なる種類のゲノムデータを統合解析を行うトランスレーショナルリサーチを行い得たという点で予定通り順調に進展していると考えられる。まだ研究期間が1年間残っていることから、さらに細胞工学的に上記に責任遺伝子の機能解析が可能であり、研究期間終了までに当初予定していた実験を遂行する目処が立っている。以上より、大腸がん多段階発がんのメカニズムをゲノムワイドに明らかにし、同定された責任候補遺伝子の機能解析を行う本研究の進捗状況は良好であると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	遺伝子変異、遺伝子発現クラスタリング、プロモータ領域のメチル化解析によって分類された患者グループの生命予後の比較は行い得た。ただし、これらのデータは大腸がんの悪性度のみを反映しているわけではなく、FOLFOX, FOLFILI, 血管新生阻害薬（アバスチンやサイラムザなど）、抗EGFR阻害薬（アービタックスやパニツマブなど）といった抗がん剤治療、分子標的治療薬に対する感受性、およびこれらの薬剤による副作用の出現率に影響される治療継続率によって大きく作用されるものと考えらえる。したがって、残りの1年で生命予後や再発率のみでなく、すべての患者の治療歴を詳細に検討することにより各薬剤感受性や不耐性に関与する遺伝子群の同定を行う。これらの解析については機能解析と平行して行うことが可能であり、また全く異なる２種類の解析方法により結果を摺り合わせることによりさらに新しい知見が得られる可能性がある。もし、抗癌剤・分子標的治療薬の投与前に薬剤感受性や不耐性を生物学的に明らかにすることが可能であれば個別化医療が可能となり現在社会問題となっている医療費の高騰に対する一定の歯止めとなり得る。このように、病院と研究所を橋渡しして行える本研究により「ベンチからベッドサイドへ」というトランスレーショナルリサーチの基本概念を達成してゆく予定であり、条件があえば研究期間が終了した後でもさらに症例数を増やしてより信頼度の高いデータを蓄積してゆく予定である。
Causes of Carryover	次世代シーケンス解析で1レーンあたり3サンプルを解析する予定であったが、一部のサンプルについては1レーンあたり4サンプルを泳動してシーケンス解析を行うことが可能であったため、1人の患者（大腸粘膜、大腸がん原発巣、肝転移巣よりそれぞれ抽出したDNAおよびRNA)あたりの解析費用が低下したために、実際に使用した研究費と当初予定していた金額との間に差が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	一部の機能解析など、実験開始時には予定していなかった解析に使用するだけでなく、研究成果が順調に出ているため、学会で発表するための旅費や参加費、また論文化に必要な英文校正費、研究成果を広めるために必要は論文別刷り代金などを研究最終年度に充てる予定である。